文献分享：Protein A层析改进新策略助力解决抗体聚集体去除难题_abio生物试剂品牌网
在抗体纯化过程中，聚集体的去除一直是个让人头疼的问题，聚集体的存在会严重影响产品质量，增加免疫原性风险。
作为抗体纯化工艺中最常用的捕获步骤，Protein A亲和层析在抗体捕获方面具有高效性，能够有效去除宿主细胞蛋白（HCP）和DNA等工艺相关杂质。
然而，在去除抗体聚集体方面，Protein A亲和层析却存在一定局限。聚集体通常与单体结合更紧密，即便通过调整洗脱pH值，仍难以实现良好的分离。因此，去除聚集体往往依赖于后续的中度纯化和精细纯化步骤，而较高含量的聚集体可能会对后续纯化工艺带来较大挑战。
今天我们来聊聊一篇文献中介绍的新策略，助力您在Protein A纯化过程中更有效地去除抗体聚集体。
聚乙二醇（PEG）+氯化钙/氯化钠组合研究团队开发了一种创新方法，显著提升了Protein A层析去除聚集体的效果。该方法在淋洗和洗脱缓冲液中加入聚乙二醇（PEG）和氯化钙/氯化钠组合，通过优化添加浓度，实现了单体和聚集体的几乎完全分离。
原理解析 PEG对Protein A洗脱峰形的影响
在本研究中，研究者尝试通过在洗脱缓冲液中加入不同浓度的PEG（1.5%、3%、5%和10%），以观察PEG对Protein A洗脱曲线的影响。
PEG作为一种广泛应用于层析的添加剂，通常可以提高单体和聚集体在羟基磷灰石、离子交换和多模式层析柱上的分辨率。这是因为PEG能够增强蛋白质在这些层析柱上的保留，且这种效应随着蛋白分子大小的增加而增强。
然而，在Protein A层析柱上，添加高达10%的PEG并未能改善单体和聚集体的分辨率，反而仅仅使目标抗体的保留时间略有增加，洗脱峰变得更尖锐。这一发现解释了为什么此前文献中没有报道在Protein A层析中使用PEG去除聚集体的方法。
氯化钙对Protein A洗脱峰形的影响
在另一项研究中，研究者发现，在Protein A洗脱缓冲液中加入500mM离液盐（如氯化钙和氯化镁）可以显著提高异源二聚体和同源二聚体在Protein A柱上的分辨率，并使这两类抗体在较高pH条件下洗脱。研究者认为，这些离液盐通过改变抗体与Protein A配基之间的疏水作用，从而提高了填料的选择性。
基于这一研究，本文进一步探讨了氯化钙在去除聚集体中的潜在应用。研究中比较了不同浓度氯化钙（250mM、500mM、750mM和1M）对Protein A洗脱峰形的影响。结果显示，氯化钙的确能够在一定程度上改善单体和聚集体的分辨率，且500mM氯化钙效果最佳。
操作建议研究表明，单纯使用PEG作为添加剂并不能有效改善Protein A柱中抗体单体和聚集体的分离效果。而氯化钙作为添加剂，能通过调整疏水作用提高分辨率，尤其在去除抗体聚集体方面具有较大潜力。
• 在Protein A层析捕获阶段，可尝试在洗脱缓冲液中加入氯化钠或氯化钙，同时配合5%PEG，以改善聚集体去除效果。
• 需根据抗体特性和聚集体含量，调整盐和PEG的浓度，推荐先进行小试验证。
• 虽然氯化钙对分辨率有正面作用，但也可能对蛋白活性造成一定影响，需在实验中进行条件筛选和参数优化，进行综合评估。
可优化参数
• PEG浓度范围：e.g. 1.5%、3%、5%、10%
• 氯化钙浓度范围：e.g. 250mM、500mM、750mM、1M
• 氯化钠浓度范围：e.g. 250mM、500mM、600mM、750mM
• 在本文案例中，以500mM氯化钙或750mM氯化钠和5%PEG组合效果最佳，分离效果显著提升。
方法优势
显著提升去除效果
• 通过向洗脱缓冲液中添加500mM氯化钙和5%PEG，洗脱液中的聚集体含量从20%降至3%~4%。
• PEG和氯化钙/氯化钠在合适浓度下表现出显著的协同作用，改善单体与聚集体的分离效果。
提升工艺稳健性• 该方法通过在Protein A捕获阶段减少聚集体含量，降低了后续精细纯化的压力，提升整体纯化工艺的稳健性。
小结通过在Protein A层析洗脱液中添加PEG和氯化钙/氯化钠组合，可以显著提升聚集体去除效果，同时保持抗体高回收率。该方法操作简便，可直接应用于现有工艺中，为抗体纯化工艺的优化提供了新思路。
参考文献
[1] Yuan Zhang et al., A method for improving protein A chromatography's aggregate removal capability, Protein Expression and Purification 158 (2019) 65–73.
