技术突破：三光子活体成像技术实现1700μm亚细胞分辨率成像_abio生物试剂品牌网
该研究由Falko Fuhrmann、Felix C. Nebeling、Fabrizio Musacchio等学者共同完成，文章题为《Three-photon in vivo imaging of neurons and glia in the medial prefrontal cortex with sub-cellular resolution》，于2025年5月在线发表于《Communications Biology》。
重要发现
01三光子成像技术的搭建与优化
为了实现对mPFC的深层活体成像，研究团队搭建了一套先进的三光子显微镜系统。该系统采用了可调谐激光（1300-1700nm），激光重复频率稳定在2MHz，并配备了900-1900nm镀膜光学元件，确保长波长激发光的有效传输。
关键的技术优化包括：
色散补偿，通过棱镜补偿器减少飞秒激光在光路中的脉冲展宽，提升荧光激发效率，使1mm深度处的高亮度荧光信号更丰富，信噪比显著提高；
物镜选择，对比多款物镜后，选用了Olympus25x水浸物镜（数值孔径1.05，传输波长至1700nm），其在1mm深度的荧光强度和信噪比表现最优；
扩大探测光学元件尺寸，增加非弹道光子的收集角度（从8°增至14°），进一步提升信号质量。这些优化让系统能穿透小鼠颅骨窗口，清晰成像mPFC的各个区域和层级。
02 深层组织成像的核心成果在神经元成像方面，研究团队在清醒固定的小鼠中，利用1300nm波长激发表达GCaMP6s的兴奋性神经元，在1400μm深度记录到240多个神经元的钙瞬变，平均振幅为4.95±4.14[%ΔF/F]，半宽为3.24±2.25秒，成功捕捉到深层神经元的活动动态。
对于星形胶质细胞，团队通过表达GCaMP5g的小鼠模型，在1200μm深度观察到其钙活动，包括离散微域的自发钙事件和胞体的钙变化，且这些活动的振幅、持续时间和频率与浅层星形胶质细胞相似，表明深层星形胶质细胞的基础功能特性具有一致性。
在小胶质细胞研究中，使用1650nm波长激发红色荧光标记的小胶质细胞，首次在1100μm深度量化其突起的运动性，发现其周转率为58.9±2%，且连续两天成像显示运动特性稳定，证明该技术的低侵入性。
此外，研究还实现了树突棘密度的长期追踪：在1mm以下深度，连续一周记录到树突棘密度为0.41±0.07μm⁻¹，为研究神经元结构可塑性提供了新工具。
创新与亮点
01突破传统成像的深度瓶颈
传统双光子成像受限于光散射，在脑组织中的成像深度通常不足1mm，且难以实现亚细胞分辨率。而本研究的三光子成像技术通过采用1300-1700nm的长波长激光，显著减少了光在深层组织中的散射和吸收，将成像深度提升至1700μm，是双光子成像的1.5倍以上。这一突破让科研人员得以探索mPFC等以往难以触及的深层脑区，为理解全脑网络连接打开了新窗口。
以往研究mPFC常依赖侵入性的GRIN透镜或微棱镜，这些方法会损伤脑组织且成像范围有限。本技术通过颅骨窗口实现非侵入式成像，避免了对脑结构的破坏。更重要的是，它能在1mm以下深度对同一批树突棘进行连续一周的追踪，且小胶质细胞在连续成像后仍保持正常运动特性，热休克蛋白检测呈阴性，证明其对细胞的干扰极小，为长期观察神经可塑性和疾病进展提供了可靠手段。
03 多细胞类型的亚细胞分辨率成像
该技术首次在深层组织中同时实现了神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的亚细胞分辨率成像。例如，能清晰观察到1000μm深度树突棘的形态（1-2μm大小），量化小胶质细胞突起的细微运动（5μm尺度），以及星形胶质细胞微域的钙信号变化。这种多维度成像能力，让科研人员能同时研究不同细胞类型在深层脑区的结构与功能关联，为揭示神经网络的协同作用提供了关键工具。
04 技术应用的广泛价值
mPFC与工作记忆、决策、情绪调控等高级认知功能密切相关，其功能异常与精神分裂症、自闭症、阿尔茨海默病等多种疾病相关。三光子成像技术的出现，为这些疾病的机制研究提供了直接观察mPFC细胞活动的手段。例如，可通过追踪树突棘密度变化了解精神疾病中的神经元结构异常，或通过小胶质细胞运动性变化监测神经炎症程度，有望加速疾病标志物的发现和新药研发。
总结与展望
本研究成功开发并应用三光子活体成像技术，在小鼠mPFC实现了1700μm深度的亚细胞分辨率成像，首次同时记录了神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的结构与功能特性，突破了传统成像技术的深度和侵入性限制。
展望未来，该技术将成为探索mPFC在认知功能（如工作记忆、情绪调控）中作用的核心工具，助力揭示阿尔茨海默病、精神分裂症等疾病的发病机制。同时，其在深层组织成像中的优势也有望扩展到其他器官研究，推动整个生物医学成像领域的发展，为精准医学和神经科学研究带来革命性突破。
论文信息声明：本文仅用作学术目的。
Fuhrmann F, Nebeling FC, Musacchio F, Mittag M, Poll S, Müller M, Ambrad Giovannetti E, MAIbach M, Schaffran B, Burnside E, Chan ICW, Lagurin AS, Reichenbach N, Kaushalya S, Fried H, Linden S, Petzold GC, Tavosanis G, Bradke F, Fuhrmann M. Three-photon in vivo imaging of neurons and glia in the medial prefrontal cortex with sub-cellular resolution. Commun Biol. 2025 May 23;8(1):795.
DOI:10.1038/s42003-025-08079-8.
