在细胞外囊泡（EVs）的众多来源中，牛奶来源的细胞外囊泡（milk-derived extracellular vesicles, mEVs）因其来源丰富、具有天然的生物活性和生物相容性等特性，被视为有潜力的下一代治疗递送平台。mEVs 被开发用于口服药物递送的载体，保护治疗药物免受胃肠道降解，改善肿瘤的靶向治疗。然而，要充分挖掘 mEVs 的治疗潜力，需深入探究其细胞摄取行为及在细胞内的转运过程，这需要依赖可靠的标记技术。目前，常用的荧光标记方法存在诸多问题：例如，亲脂性染料标记存在染料脱落、自聚集、转移以及影响囊泡完整性等问题；常用的共价标记技术，如N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）酯染料标记，需要借助蛋白表面的伯胺，可能会改变囊泡表面蛋白的功能；基因工程标记则不适用于非培养来源的囊泡（如 mEVs），在实际应用中受到限制。因此，开发一种简单、稳定且对囊泡结构和功能影响较小的标记方法显得尤为关键。

日前，集美大学陈超翔教授团队在 Small Methods 发表题为“Glycan-Anchored Fluorescence Labeling of Milk-Derived Extracellular Vesicles for Investigating Their Cellular Uptake and Intracellular Fate”的文章，报道了一种“聚糖锚定”荧光标记策略。该策略通过氧化 mEVs 表面的唾液酸残基，与荧光染料共价连接，从而实现对 mEVs 的高效标记。经纳米流式（NanoFCM）分析证实该方法的标记效率近 100%，且 mEVs 的完整性和生物功能不受影响。这一创新的标记技术为深入研究 mEVs 的细胞摄取、细胞内转运机制以及药物递送效率提供了有力的支持，有望推动基于 mEVs 的新型药物递送系统的研发和临床应用。

01 聚糖锚定荧光标记策略
研究者通过高碘酸盐氧化 mEVs 表面的唾液酸产生醛基，再经苯胺催化与含酰肼功能化的荧光团（Cy5-酰肼）进行共价结合，实现荧光标记（图1a）。然后，利用 NanoFCM 对标记后的 mEVs 进行分析，荧光检测显示约 100% 的 mEVs 成功标记了 Cy5，证实该方法具有极高的标记效率（图1c, d）。同时，研究发现该标记不影响 mEVs 的物理性质、蛋白标志物和细胞摄取能力，且在不同温度和 pH 条件下稳定性良好，对多种来源的 EVs 均适用（图2）。
 

图1. NanoFCM 评估聚糖锚定荧光标记 mEVs 的效率

图2. 聚糖锚定荧光标记不同来源 EVs 的效率
02  与亲脂性标记方法的对比
研究者利用 NanoFCM 对聚糖锚荧光标记方法与亲脂染料标记方法从标记效率、稳定性以及对囊泡特性的影响进行系统比较。结果显示，聚糖锚定标记法在所有测试的 mEVs 浓度下，均展现出近乎 100% 的标记效率，且不会引发囊泡的聚集或裂解（图3a-d），充分显示出该方法的高效性与稳定性。而亲脂性染料（如 DiD、PKH67、DiO）的标记效果则因浓度依赖性导致结果不稳定，低浓度时标记效率不足，高浓度则导致 mEVs 聚集、裂解和染料自聚集（图3）。   图3. 通过 NanoFCM 比较聚糖锚定标记与亲脂性荧光标记
03  mEVs 的细胞摄取和胞内转运
研究者将 mEVs-Cy5 与 MCF-7 细胞共同孵育，通过流式细胞术（FCM）检测发现，随着孵育时间的延长，细胞的荧光强度在 8 小时达到峰值，随后略有下降，表明 mEVs 摄取存在饱和状态（图4b, c）。此外，研究发现细胞的荧光强度与 Cy5 标记密度呈严格的线性关系，这充分说明标记过程并未影响 mEVs 的细胞摄取能力（图4d）。进一步，通过 NanoFCM 对细胞培养基中 mEVs-Cy5 的浓度变化进行准确定量。结果显示，与 MCF-7 细胞共孵育后，mEVs-Cy5 的浓度显著降低，证实细胞成功摄取了 mEVs。经基于浓度变化的计算，每个 MCF-7 细胞平均摄取了约 2938 个 mEVs（图4h）。   图4. mEVs 细胞摄取的定量分析
通过抑制剂实验，研究者进一步分析了 mEVs 在细胞内的转运路径，并确定其进入细胞主要通过网格蛋白介导的内吞和巨胞饮作用。此外，通过共聚焦激光荧光显微镜观察，发现 mEVs 最初与溶酶体共定位，但 24 小时后部分 mEVs 成功从溶酶体中逃逸（图5a-g）。上述发现揭示了 mEVs 在细胞内的转运特征，为其在细胞质中释放药物提供了潜在的作用机制和理论依据。   图5. mEVs 的细胞摄取途径和细胞内运输的研究
04  药物递送和细胞毒性
为了评估 mEVs 作为药物递送载体的潜力，研究者将化疗药物紫杉醇（FITC标记，PTX-FITC）装载至 mEVs 中，并利用新方法实现双重标记（Cy5标记mEVs，FITC标记药物）。通过 NanoFCM 分析，发现约 90% 的 mEVs 成功装载了 PTX-FITC，进一步的共标记实验表明，装载了 PTX 药物的 mEVs 均标记上了 Cy5，双阳性比例高达 86.6%。相比之下，传统亲脂性染料 DiD 标记显著减弱了 mEVs 载药的能力（图6b-d）。综上结果表明，mEVs 具备高效装载药物的能力，且聚糖锚定标记不影响 mEVs 的载药能力。

进一步通过 FCM 实时跟踪细胞摄取过程，结果显示，细胞内 Cy5 荧光强度在 8 小时达到峰值，而 FITC 荧光强度在 24 小时后显著增加。此外，利用 FITC 的 pH 敏感荧光特性，研究者观察到其荧光信号的变化，证实了 mEVs 能够逃离溶酶体，并将携带的药物以“爆发式”方式释放至细胞质中（图6f-h）。癌细胞毒性实验也显示，mEVs-PTX-FITC 在作用 24 小时后显示出显著的细胞毒性（图6i），这一结果证明，mEVs 能够有效地将药物递送到细胞内，并发挥治疗效果。   图6. mEVs 的载药能力和细胞毒性分析
总 结
本研究通过开发基于聚糖锚定的荧光标记技术，克服传统标记方法的局限性，实现了对 mEVs 的高效、稳定标记。此种标记方法不会损害 mEVs 的完整性或摄取行为，也不会诱导囊泡聚集或染料泄漏，其综合表现显著优于传统的膜染料。已有数据表明，基于聚糖锚定的荧光标记技术具有广泛的适用性，已在多种来源的 EVs 中成功实现。此外，本研究还评估了 mEVs 作为药物递送载体的潜力，装载了紫杉醇的 mEVs 在癌细胞内展现出显著的杀伤作用，有力证实了其作为药物递送载体的潜力。该技术不仅为 EVs 的细胞摄取和药物递送机制提供了重要理论依据，还为基于 EVs 的靶向药物递送进一步研究和应用铺平了道路。