癌症仍是全球主要疾病负担和死亡原因之一。2022 年，全球新发癌症病例接近 2000 万，预计 2050 年全球将新增超过 3500 万癌症病例。而传统治疗方法，如化疗、放疗和免疫治疗等，常因缺乏特异性、毒副作用大以及易产生药物耐药性等问题，限制了其临床应用。因此，亟待开发新型、高效、低毒的新型治疗策略。

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）因其生物相容性高、免疫原性低和高效的药物递送能力，已成为极具潜力的药物递送平台，为癌症治疗打开了突破性方向。日本金泽大学的研究团队近期开发了一种有前景的癌症治疗新方法，有望成为更具针对性的、副作用更少的癌症疗法。研究团队开发了一种特殊的工程化 EVs，称为抗原呈递细胞外囊泡（antigen-presenting EVs, AP-EVs），可以激活肿瘤内的免疫细胞。这些 AP-EVs 能够把免疫增强信号高效递送至肿瘤微环境，激活抗原特异性 CD8+ T 细胞，并将“冷”肿瘤微环境转化为“热”微环境，在与 PD-1 疗法联用时显著增强抗肿瘤效果。这种新方法不仅增强了免疫反应，同时还减少了传统癌症治疗中常见的副作用。该成果发表在 2025 年 3 月 28 日的《Journal of Extracellular Vesicles》。

AP-EVs 的构建与表征
研究团队首先将卵清蛋白肽-单链 MHC I 三聚体（pMHCI）与 CD81 融合，IL-2 通过 GS 连接子整合至 CD81 的第二个外部环，并将 CD80 与 CD9 融合，成功构建了同时表达 pMHCI、CD80 和 IL-2 的 AP-EVs（图1a）。通过流式细胞术分析，确认磁珠富集的 AP-EVs 表面高表达 pMHCI、CD80 和 IL-2（图1b）。进一步通过纳米流式检测技术（NanoFCM）在单个 EV 水平进行分析，发现超 50% 的 AP-EVs 表面同时表达 IL-2 和 CD80（图1d）。此外，纳米颗粒追踪分析和原子力显微镜分析确认 AP-EVs 的物理性质与对照 EVs 类似（图1e，f）。这些结果充分证实了 AP-EVs 的成功构建，为其在后续的免疫调节和癌症治疗研究奠定了基础。

图1. AP-EVs 的构建与表征

体外实验：AP-EVs 选择性扩增抗原特异性 CD8+ T 细胞
研究团队将 OT-I T 细胞（注：OT-I T 细胞为 MHC I 类限制性的卵清蛋白特异性 CD8+ T 细胞）与不同浓度的 AP-EVs 或对照 EVs 共同培养，使用 CTV 标记 OT-I T 细胞，通过流式细胞术分析 OT-I T 细胞的增殖和激活情况，在体外评估 AP-EVs 扩增抗原特异性 CD8+ T 细胞的能力。实验结果显示，AP-EVs 能够以剂量依赖的方式激活 OT-I T 细胞（图2a）。此外，研究者分别对比了高表达不同标志物组合的 AP-EVs，发现 pMHCI、CD80 和 IL-2 的协同作用是激活 T 细胞的关键（图2b,c，其中，Signal 1：OVAp-MHCI；Signal 2：CD80；Signal 3：IL-2）。进一步，研究团队还评估了 AP-EVs 激活的 OT-I T 细胞的功能化程度，发现 IFN-γ 和颗粒酶 B 显著升高，表明这些 T 细胞产生肿瘤免疫效应因子并分化为细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）（图2d）。此外，在与多克隆 T 细胞共培养时，AP-EVs 仅选择性扩增 OT-I T 细胞，而对照 EVs 组并未表现出选择性扩增（图2e-f）。这些结果表明，直接呈递抗原、共刺激分子和细胞因子的 AP-EVs 能够诱导抗原特异性 CD8+ T 细胞的强劲增殖。研究团队还评估了 AP-EVs 的稳定性，发现即使在 4℃ 或 -20℃ 下保存 3 个月，AP-EVs 仍能保持与新鲜制备的 EVs 相当的活性，这为 AP-EVs 的临床应用提供了便利（图2g）。

图2. AP-EVs 体外激活抗原特异性 CD8+ T 细胞

体内实验：AP-EVs 在小鼠模型中的免疫反应
为了深入探究 AP-EVs 在体内扩增抗原特异性 CD8+ T 细胞的能力，研究团队选用 C57BL/6 小鼠接种 E.G7 肿瘤构建实验动物模型，接种后，转移 OT-I T 细胞至小鼠，并注射 AP-EVs、对照 EVs 或 IL-2/抗 IL-2 单抗，收集脾脏和淋巴结，分析 T 细胞的增殖、活化、分化状态。实验结果表明，AP-EVs 显著增加了抗原特异性 CD8+ T 细胞比例（图3a-c），并促进分化为效应 T 细胞，同时提高 IFN-γ+ 的分泌（图3d, e），相比 IL-2/抗 IL-2 单抗治疗组，AP-EVs 能更有效地选择性扩增抗原特异性 CD8+ T 细胞，且副作用较少。此外，正电子发射断层扫描（PET）成像显示，AP-EVs 主要富集于小鼠的脾脏和肝脏（图3f-g）。综上，无论体内体外，AP-EVs 能够特异性扩增抗原特异性 CD8+ T 细胞，并具有良好的体内分布与免疫效果。

图3. AP-EVs 在体内激活抗原特异性 CD8+ T 细胞

AP-EVs 体内抗肿瘤效果
研究团队为了评估 AP-EVs 体内抗肿瘤能力，将 E.G7 肿瘤小鼠分为 AP-EVs 组、对照 EVs 组、IL-2/抗 IL-2 单抗组、AP-EVs 与抗 PD-1 联合治疗组，定期注射治疗，检测肿瘤生长情况和小鼠生存期。实验结果显示，经 AP-EVs 治疗后，内源抗原特异性 CD8+ T 细胞扩增的比例从 0.025% 提升至 3.58%（图4a），且这些激活的 CTLs 能够高效清除抗原特异性的靶细胞（图4b），与对照 EVs 组、IL-2/抗 IL-2 单抗组相比，接受 AP-EVs 治疗的小鼠肿瘤生长显著延缓，生存期显著提高（图4c）。此外，AP-EVs 与抗 PD-1 免疫检查点抑制剂联合使用时，可进一步抑制肿瘤生长并延长小鼠的生存期（图4d），这表明 AP-EVs 与免疫检查点抑制剂存在协同效应。

图4. AP-EVs 的体内抗肿瘤效果

AP-EVs 改变肿瘤微环境
研究团队采用 E.G7 肿瘤小鼠模型，进一步对 AP-EVs 的抗肿瘤机制进行了探索。实验结果显示，在 AP-EVs 处理的小鼠中，肿瘤组织中 CD8+ T 细胞的比例显著增加，尤其是 IFN-γ+ CD8+ T 细胞，而 PD-1+ CD8+ T 细胞的比例显著下降，表明 AP-EVs 能够有效激活 CD8+ T 细胞，促进其分泌免疫效应因子（图5a-d）。进一步的 PET 成像动态示踪显示，AP-EVs 在肿瘤组织中呈现显著蓄积，其蓄积水平与肝脏和脾脏相当（图5e），并且随给药后时间推移，肿瘤组织中的 AP-EVs 蓄积呈现逐渐增强的趋势（图5f）。这些发现表明，AP-EVs 不仅能够直接激活抗原特异性 CD8+ T 细胞，还可以通过改变肿瘤微环境来增强抗肿瘤免疫反应。

图5. AP-EVs 对肿瘤微环境的影响

AP-EVs 的临床转化潜力
为了使 AP-EVs 能够在临床上应用，研究团队通过 CRISPR-Cas9 技术敲除人细胞系中 β2m 的表达，确保 AP-EVs 能与人类免疫系统匹配，随后，将目的基因转染至细胞中，成功获得能够携带肿瘤抗原（NY-ESO-1）、CD80、IL-2 的人源化 AP-EVs（hAP-EVs）。实验结果显示，hAP-EVs 能有效激活人原代 CD8+ T 细胞，促进其增殖并分化为具有细胞毒性的效应 T 细胞（图6a-e）。此外，在 hAP-EVs 中加入细胞间黏附分子-1（ICAM-1）后，其激活 T 细胞的能力得到进一步提升。这些发现不仅证实并凸显了 hAP-EVs 在体外激活人类 T 细胞的治疗潜力，更为其后续的临床转化奠定了重要基础。

图6. hAP-EVs 体外诱导人抗原特异性 T 细胞扩增、活化和效应功能

总结与展望
本研究开发了一种抗原呈递细胞外囊泡，通过共表达抗原肽-MHC 复合物、共刺激分子及细胞因子，高效激活并扩增了肿瘤特异性 CD8+ T 细胞。AP-EVs 不仅能增强抗原特异性 T 细胞的细胞毒性，还能重塑肿瘤微环境，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，从而显著增强抗肿瘤免疫反应。此外，AP-EVs 与抗 PD-1 抗体联用展现出显著的协同增效作用，进一步提升了抗肿瘤疗效，为癌症免疫治疗开辟了新的联合策略。该研究不仅创新性地提供了一种高效的肿瘤免疫调节手段，也极大地推动了 EVs 作为药物递送平台向临床应用的转化，凸显了其深远的科学价值与广阔的临床应用前景。

NanoFCM 在单颗粒水平对 EVs 表面的多种蛋白进行了精准的表型分析，验证了 AP-EVs 是否成功表达了关键免疫调节成分。这种精确的单囊泡水平分析对于评估 AP-EVs 的质量属性和功能至关重要，是保障其有效激活抗原特异性 CD8+ T 细胞不可或缺的环节。NanoFCM 作为单 EV 表征的重要技术手段，将在精准医学领域发挥越来越重要的作用，加速推动 EV 药物从基础研究向临床转化。

参考文献：
Lyu X, Yamano T, Nagamori K, et al. Direct delivery of immune modulators to tumour-infiltrating lymphocytes using engineered extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2025;14:e70035