锌指核酸酶是一种人工合成的 DNA 结合蛋白，由两部分构成： ①锌指 DNA 结合域 来自真核转录因子，负责识别并靶向特定的 DNA 序列。锌指 DNA 结合域由三组锌指组成，每组锌指由大约 30 个氨基酸与一个锌原子相连，分别结合 3 bp 的 DNA 序列。 ② DNA 切割域 来自 FokI 限制性内切酶，它以二聚体的形式执行其功能，分别靶向不同的 DNA 链，非特异性切割 5-7 bp 的间隔序列。在设计 ZFN 时可以对 FokI 进行突变，使之形成具有核酸酶活性的异源二聚体，可以增加其对 DNA 序列识别的特异性。
如图所示，一对串联的锌指 DNA 结合基序将 FokI 的两个亚基引导至特定基因组位点，对目的 DNA进行切割产生 DSB。需要注意的是，锌指核酸酶的合成和组装程序比较复杂且成本较高。
  ZFN 结构示意图
优点

1. 早期实用性：作为首个成熟的基因编辑技术，为后续技术（如 TALEN、CRISPR）奠定了基础。
2. 一定特异性：相比早期的随机突变技术，可实现对特定基因的编辑。

缺点

1. 设计难度高：锌指与 DNA 的结合存在 “上下文依赖”—— 单个锌指的识别受相邻锌指影响，难以通过简单规则设计，需大量筛选验证。
2. 脱靶风险：部分 ZFNs 可能结合非目标序列，导致脱靶切割，引发基因突变风险。
3. 构建复杂：筛选高效、特异的 ZFNs 耗时费力，成本较高。
4. 适用范围有限：并非所有 DNA 序列都能找到对应的锌指组合，靶向灵活性较低。

目前 ZFNs 的应用已大幅减少，但在部分领域仍有一席之地：

• 少数基因治疗公司（如 Sangamo Therapeutics）仍在推进基于 ZFNs 的临床试验（如血友病治疗）；
• 其 “蛋白 - DNA 识别 + 核酸酶切割” 的设计思路，为后续基因编辑工具的开发提供了重要参考。

  总体而言，ZFNs 开启了精准基因编辑的时代，虽被更高效的技术替代，但其在基因编辑技术发展中的奠基作用不可忽视。