Pipetty电动移液器在动物布鲁氏菌病检测（荧光RAA）中的应用_abio生物试剂品牌网
方案摘要：本方案聚焦 PIpetty 电动移液器在动物布鲁氏菌病荧光 RAA（重组酶介导等温扩增）检测中的应用，通过精准移液、高效分液与智能操作三大核心优势，显著提升检测效率与准确性。Pipetty 凭借高精度移液及温度补偿功能，确保反应体系中引物、探针等关键试剂添加量的一致性，有效降低假阴性与假阳性率；其连续分液模式可使 96 孔板操作时间缩短 80%，为动物疫病快速诊断提供标准化、可追溯的解决方案，尤其适用于基层兽医站、海关口岸等检测场景。
方案详情：
一、实验原理
动物布鲁氏菌病荧光 RAA 检测基于重组酶介导等温扩增技术。在 37-42℃恒温下，重组酶与引物结合形成复合物，识别并结合布鲁氏菌 DNA 模板，解开双链启动扩增；单链结合蛋白稳定单链结构，链置换 DNA 聚合酶延伸新链，实现指数级扩增。引物或探针标记荧光基团与淬灭基团，扩增过程中荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光信号，通过实时监测荧光强度判断样本中是否存在布鲁氏菌 DNA，实现快速、灵敏检测。
二、 实验准备
1、设配和材料
① Ⅱ级生物安全柜。
② 干式加热器。
③ 水浴锅。
④ 荧光 PCR 扩增仪及配套 PCR 管。
⑤ 台式高速冷冻离心机（离心力≥12000g）。
⑥ 冰箱（2 ℃~8 ℃、-20 ℃，-80 ℃）。
⑦ Pipetty电动移液器0.1-20 μL、1-250 μL、5-1000 μL）及无菌枪头。
⑧ 恒温荧光基因检测仪及配套反应管。
⑨ 样品前处理系统。
2、试剂和材料
① 荧光基础反应单元（含重组酶,单链结合蛋白和 DNA 聚合酶的冻干粉）及配套缓冲液。
② 乙酸镁（140 mmol/L）。
③ 阳性对照，为参考菌株（牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌基因组以及 A19 和 S2 疫苗株等） DNA，可使用 10 2 CFU/mL~10 3 CFU/mL 的细菌 200 μL 提取细菌DNA。
④ 阴性对照，为 ddH 2O。
三、实验步骤
1、疑似布鲁氏菌分离株的灭活：在生物安全柜内，用接种环从培养皿上挑取单个疑似菌落或多个经纯培养的疑似菌落，加入含 200 uL的 PBS 或 ddH 2O 的离心管中，使用Pipetty电动移液器，设置自动混匀功能，吹打均匀，密封管盖，置于干式加热器，80 ℃灭活 2h。
2、将全血样 、乳样、组织样、拭子样及液体样，进行处理后，置于干式加热器或水浴锅，80 ℃灭活2 h。
3、菌株及样品 DNA提取，可采用细菌 DNA 提取试剂盒，按说明书规定程序提取样品 DNA，也可采用酚-三氯甲烷-异戊醇抽提法，步骤如下：
a）使用Pipetty电动移液器取 200 μL 处理过的样品放入离心管，加入裂解液（10 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaC1，0.5% SDS，200 μg/ml 蛋白酶K）200μL，56 ℃消化2h，12000g离心 20s，取上清液置于另一个管中，然后加入等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）混合物，上下颠倒3~4次混匀。
b）4℃ 7000g离心10 min，移上层液相置于另一个管中，加入 2.5倍体积预冷 70%（体积分数）乙醇，-20 ℃沉淀 30 min，12000g离心10 min，弃去液相，加入1mL 70%(体积分数）乙醇漂洗，12000g 离心 2 min~3 min，弃去液相，留取沉淀，真空或室温干燥，加入 20μL ddH 2O，-20 ℃保存备用。
4、按表2配制RAA反应混合液。
5、将 40 μLRAA 反应混合液加入 RAA 荧光基础反应单元管中。
6、将 5μL 乙酸镁（反应催化剂）加在反应单元管盖内侧。
7、向反应单元管中依次加入 5μL 待测核酸，最后扣紧反应单元管盖。
8、将反应单元管置于样品前处理系统中，39 ℃下按程序运行 4 min。
9、将反应单元管放入恒温核酸扩增检测仪，设置扩增温度为 39 ℃，扩增时间 30 min，每隔 20s收集荧光信号。注：样品前处理系统和恒温核酸扩增检测仪提前 30 min�A热。
四、结果判定
1、同时满足以下条件，可判定试验成立，否则应重新试验。
a)阳性对照出现特异性扩增曲线，扩增曲线的斜率K≥20；
b)阴性对照无特异性扩增曲线，扩增曲线的斜率K<20。
2、在满足上述的条件下，当样品扩增曲线的斜率 K≥20 时，可判为阳性，否则判为阴性。
方案详情：
一、实验原理
动物布鲁氏菌病荧光 RAA 检测基于重组酶介导等温扩增技术。在 37-42℃恒温下，重组酶与引物结合形成复合物，识别并结合布鲁氏菌 DNA 模板，解开双链启动扩增；单链结合蛋白稳定单链结构，链置换 DNA 聚合酶延伸新链，实现指数级扩增。引物或探针标记荧光基团与淬灭基团，扩增过程中荧光基团与淬灭基团分离，释放荧光信号，通过实时监测荧光强度判断样本中是否存在布鲁氏菌 DNA，实现快速、灵敏检测。
二、 实验准备
1、设配和材料
① Ⅱ级生物安全柜。
② 干式加热器。
③ 水浴锅。
④ 荧光 PCR 扩增仪及配套 PCR 管。
⑤ 台式高速冷冻离心机（离心力≥12000g）。
⑥ 冰箱（2 ℃~8 ℃、-20 ℃，-80 ℃）。
⑦ Pipetty电动移液器0.1-20 μL、1-250 μL、5-1000 μL）及无菌枪头。
⑧ 恒温荧光基因检测仪及配套反应管。
⑨ 样品前处理系统。
2、试剂和材料
① 荧光基础反应单元（含重组酶,单链结合蛋白和 DNA 聚合酶的冻干粉）及配套缓冲液。
② 乙酸镁（140 mmol/L）。
③ 阳性对照，为参考菌株（牛种、羊种、猪种、犬种布鲁氏菌基因组以及 A19 和 S2 疫苗株等） DNA，可使用 10 2 CFU/mL~10 3 CFU/mL 的细菌 200 μL 提取细菌DNA。
④ 阴性对照，为 ddH 2O。
三、实验步骤
1、疑似布鲁氏菌分离株的灭活：在生物安全柜内，用接种环从培养皿上挑取单个疑似菌落或多个经纯培养的疑似菌落，加入含 200 uL的 PBS 或 ddH 2O 的离心管中，使用Pipetty电动移液器，设置自动混匀功能，吹打均匀，密封管盖，置于干式加热器，80 ℃灭活 2h。
2、将全血样 、乳样、组织样、拭子样及液体样，进行处理后，置于干式加热器或水浴锅，80 ℃灭活2 h。
3、菌株及样品 DNA提取，可采用细菌 DNA 提取试剂盒，按说明书规定程序提取样品 DNA，也可采用酚-三氯甲烷-异戊醇抽提法，步骤如下：
a）使用Pipetty电动移液器取 200 μL 处理过的样品放入离心管，加入裂解液（10 mmol/L EDTA，150 mmol/L NaC1，0.5% SDS，200 μg/ml 蛋白酶K）200μL，56 ℃消化2h，12000g离心 20s，取上清液置于另一个管中，然后加入等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）混合物，上下颠倒3~4次混匀。
b）4℃ 7000g离心10 min，移上层液相置于另一个管中，加入 2.5倍体积预冷 70%（体积分数）乙醇，-20 ℃沉淀 30 min，12000g离心10 min，弃去液相，加入1mL 70%(体积分数）乙醇漂洗，12000g 离心 2 min~3 min，弃去液相，留取沉淀，真空或室温干燥，加入 20μL ddH 2O，-20 ℃保存备用。
4、按表2配制RAA反应混合液。
5、将 40 μLRAA 反应混合液加入 RAA 荧光基础反应单元管中。
6、将 5μL 乙酸镁（反应催化剂）加在反应单元管盖内侧。
7、向反应单元管中依次加入 5μL 待测核酸，最后扣紧反应单元管盖。
8、将反应单元管置于样品前处理系统中，39 ℃下按程序运行 4 min。
9、将反应单元管放入恒温核酸扩增检测仪，设置扩增温度为 39 ℃，扩增时间 30 min，每隔 20s收集荧光信号。注：样品前处理系统和恒温核酸扩增检测仪提前 30 min�A热。
四、结果判定
1、同时满足以下条件，可判定试验成立，否则应重新试验。
a)阳性对照出现特异性扩增曲线，扩增曲线的斜率K≥20；
b)阴性对照无特异性扩增曲线，扩增曲线的斜率K<20。
2、在满足上述的条件下，当样品扩增曲线的斜率 K≥20 时，可判为阳性，否则判为阴性。
