文献信息
农业农村部淡水水产学院淡水动物养殖重点实验室、湖北洪山实验室、教育部长江经济带大宗水生生物产业绿色发展工程研究中心、华中农业大学湖北省鱼类养殖工程技术研究中心、广东岭南现代农业实验室的研究成果“Generation of blunt snout bream without intermuscular bones by runx2b gene mutation”（基于runx2b基因敲除的无肌间刺团头鲂新种质创制）在海洋与淡水生物学领域的顶级期刊《Aquaculture》杂志上发表。平生公司的离活一体CT（NEMO）在论文中提供团头鲂样品的鱼骨图像和定量分析。该研究的通讯作者为高泽霞教授、万世明教授。第一作者为董强、聂春红。

文献摘要
团头鲂（Megalobrama amblycephala）是我国重要的食草性淡水经济鱼类。其经济价值受到肌间刺（IBs）存在的影响。作者之前的研究证明，runx2b是肌间刺形成的关键基因，通过敲除runx2b基因可以获得稳定的无肌间刺斑马鱼突变体。作者发现，通过CRISPR/Cas9编辑技术，F0代runx2b突变体团头鲂肌间刺的数量显著减少。为了进一步获得无肌间刺的团头鲂，作者通过F0代runx2b突变体团头鲂进行自交，获得F1代团头鲂突变体。随后，对35尾F1代runx2b无肌间刺突变体进行基因分型，发现突变类型为：3种（靶点1）、13种（靶点2）、7种（靶点3）的，runx2b靶点1、2和3的突变效率分别为25.71%、94.28%和71.43%。茜素红骨染色和X射线扫描分析表明，F1代runx2b无肌间刺突变体中没有肌间刺，显微CT分析发现，与野生型鱼类相比，F1代runx2b无肌间刺突变体中其他骨骼的矿化没有受到显著影响（P>0.05）。RT-qPCR结果还表明，与野生型鱼类相比，F1代runx2b无肌间刺突变体中骨相关基因的表达水平较低。随后，作者使用国家标准方法在120dpf下检测野生型团头鲂（有肌间刺）和F1代runx2b无肌间刺突变体（无肌间刺）肌肉组织的营养成分。结果表明，野生型团头鲂和F1代runx2b无肌间刺突变体在幼鱼期的基本肌肉营养成分（水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分）以及大多数氨基酸和脂肪酸的含量没有显著差异（P>0.05）。本研究证明，runx2b基因对水产养殖鱼类中肌间刺的形成起着至关重要的作用，并为获得一种新的无肌间刺团头鲂品系奠定了重要基础，为无肌间刺性状在经济型鱼类中的应用提供了一个很好的例子。

实验方法
使用MS-222对四个月大的野生型和F1代团头鲂突变体进行安乐死，并将其固定在4% PFA溶液中24小时。团头鲂的扫描是在平生医疗科技（昆山）有限公司（PINGSENG Healthcare Inc.）的Nemo Micro-CT（NMC-200）设备上完成。该设备采用锥形束CT(cone beam CT)技术，是一种能够达到高分辨率的成像技术。使用微计算机断层扫描（μCT）（NEMO^®micro-CT，平生医疗，中国）以50μm的体素大小（使用90 kV的X射线管电位，65μA的X射线强度）扫描七个鱼类样本（4 runx2b+/+，3 runx2b−/−）。扫描过程中探测器和球管围绕样品舱中轴做360°旋转，并在扫描区域内进行10000次投射，整个扫描时间为3500s。在探测器捕获图像后，将其传输到计算机中，然后在Avatar软件（版本1.7.2，PINGSENG Healthcare Inc.）上采用FDK法逆向重建出图像，像素大小为50um×50um×50um。斑马鱼的组织密度测量是在用小鼠胫骨的标准骨密度体模（QRM Mirco CT HA，Moehrendorf，Germany）校准后进行的。使用阈值技术手动追踪脂肪（-200 < CT值 ≤ -80）和肌肉（-80 < CT值 ≤ 280）区域。通过使用FDK算法的3D重建软件获得脂肪和肌肉体积的量化。在用小鼠胫骨的标准骨密度模型（QRM-MircoCT-HA，德国Moehrendorf）校准后，对团头鲂进行组织矿物质密度测量。

实验结果
为了揭示肌间刺发育早期runx2b基因功能丧失后的肌间刺表型，通过茜素红骨染色观察了runx2b突变体F1代的肌间刺表型，并在45dpf的60尾runx2b突变体F1代团头鲂中发现了27尾（45%）没有肌间刺（图4A）。当runx2b突变体F1代生长到四月龄时，使用X射线筛选runx2b突变体F1代团头鲂个体共5000尾，最终发现316尾（6.32%）完全没有肌间刺的团头鲂个体（图4B）。同样，Micro-CT结果显示，runx2b突变体F1代团头鲂个体没有肌间刺，而野生型有肌间刺（图4C）。如图4D所示，实验结果表明，在120dpf时，野生型（有肌间刺）和runx2b突变体（无肌间刺）的其他骨元素的组织矿物质密度（TMD）值没有显著差异（P>0.05）。

图4 野生型和runx2b突变个体的肌间刺表型。A、茜素红骨染色45dpf；B、X-ray扫描；C、 Micro CT扫描。D、组织矿物质密度（TMD）值四种不同的骨元素。

使用结论
本实验获得的无肌间刺团头鲂F1代将为后续培育能稳定遗传的无肌间刺团头鲂新品种奠定重要基础，同时，本研究也是首次以团头鲂为实验对象展开的无刺经济型鱼类新品种的研究，为无肌间刺性状在经济型鱼类中的应用提供一个很好的例子，但runx2b调控鱼类肌间刺发生发育的分子机制还有待进一步阐明。此外，因runx2b基因缺失而获得的无肌间刺团头鲂的骨骼发育、生长、游动性能和肌肉营养成分还需要进行更全面系统的评估。

使用设备

 Micro CT (型号：NEMO) (平生医疗科技)
影像软件：Avatar（平生医疗科技）