小鼠原代小肠类器官培养实验步骤及应用指南_abio生物试剂品牌网
应用指南 | 小鼠原代小肠类器官培养实验
#应用指南#
2009 年，Hans Clevers 及其团队利用 Lgr5+ 肠干细胞在体外培养出了三维小肠类器官结构。这种结构反映了肠上皮细胞的生理状况，可进行长期体外培养，同时保持细胞分化能力。这种方法越来越多地用于干细胞研究、疾病模型和再生医学。
小肠类器官既可以用多能干细胞或胚胎干细胞培养，也可以用小肠隐窝干细胞培养。后者由于方便、技术简单、可多次传代，可进行长达两个月的长期体外培养，因此更为常见。
本应用说明重点介绍了 GelNestTM 基质胶在小鼠肠道原代组织类器官培养中的应用。
材料与方法
Part.01 原代小肠组织提取消化
1. 将小鼠安乐死。从回肠末端采集 15 厘米长的肠管。
2. 去除外膜，用冷的 PBS 冲洗。用剪刀剪开肠段，使肠腔朝上。用冰冻 PBS 轻轻清洗剪开的肠段。
3. 在 50 mL 离心管中加入 15 mL 冰冷 PBS。用剪刀将肠管剪成 1~2 mm 的小段，然后用 PBS 冲洗。重复清洗步骤，直至清澈为止。
4. 去除上清液，将组织碎片重悬于 25 mL 肠隐窝消化液（含 2-5mM EDTA）中，冰浴 20 分钟，然后在 20 rpm 旋转床上旋转 30 分钟。去除上清液。
5. 将组织碎片重悬于 10 mL 含有 10% FBS 的冷（2-8℃）PBS 缓冲溶液中。用 70 μm 过滤器过滤上清液，并将滤液装入 50 mL 的干净试管中。重复过滤 3 次，合并滤液。
6. 300×g 离心 5 分钟。弃去上清液。
7. 将沉淀重悬于 10 mL PBS 缓冲溶液中。200×g 离心 3 分钟。除去上清液。如果悬浮液中单细胞过多，请重复离心步骤。
Part.02 小肠隐窝计数筛选与接种
1. 取 10 μL 细胞样本，在显微镜下计数隐窝。200×g 离心 3 分钟，取出上清液。
注：适合培养的隐窝大小不一，通常呈长方形或圆形，边缘相当光滑，看起来像上皮单层的小的折叠部分。绒毛、单细胞或碎屑浓度较高的部分不是类器官培养的理想选择。目标是最大程度地富集合适的隐窝。
2. 将隐窝重悬在肠类器官完全培养基中，每微升培养基含 8-20 个隐窝。制作完全培养基时，加入：
3. 取 150 μL 隐窝悬浮液，与等体积未稀释的 GelNestTM 类器官专用基质胶（NEST 211272）混合，然后轻轻地用移液管上下移动十次，使其充分混合。
4. 将 50 μL 样品加入预热好的 24 孔板的每个孔的中心，形成圆顶状结构。避免形成气泡。
5. 将平板置于 37℃，静置 10 分钟，使基质凝胶凝固。小心处理平板，避免干扰凝胶。
6. 小心地向每个孔中加入 500 μL 室温（15-25℃）类器官培养基，从侧面倒入以避免扰动凝胶。
Part.03 类器官培养与观察
1. 监测类器官的生长。通常，在培养 3 小时左右，隐窝形成球形结构。2-4 天后，类器官开始出芽，到第5-7 天形成复杂结构。
2. 第二天完全更换培养基。小心去除孔边缘的旧培养基，加入 500 μL 新鲜的室温类器官培养基。
3. 定期在倒置显微镜下观察肠类器官并记录。
4. 选择合适的抗体对类器官进行染色，并在荧光显微镜下观察，同时包括适当的特异性对照。
5.使用NEST免费的类器官AI大模型分析软件进行识别批量、无标记分析由显微镜获取的类器官照片（不限显微镜品牌），帮助您更快、更准确的获得类器官的数量、大小（面积）、圆度、周长、灰度值（可统计荧光照片的不同类器官/细胞球的荧光强度，或明场照片的类器官亮度，从而反应类器官的死活状态）等参数，并生成统计分析结果。
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实验结果分析
图 1. 小鼠小肠类器官在 GelNestTM 基质胶中的生长情况。
在第 2 天在 10 倍物镜下，可观察到小型空泡状结构；在第 3 天可观察到明显变大的空泡结构；在第 6 天可观察到具有多个出芽结构的小肠类器官，且培养皿里的类器官可肉眼直接观察到白色颗粒状细胞团。标尺为 200 微米。
图 2. 早期小肠类器官的细胞骨架蛋白和细胞增殖抗原的免疫染色结果。
可观察到在 GelNestTM 基质胶中生长的早期的小肠类器官为单细胞层形成的空泡结构，并且将小肠类器官种在 100 倍稀释的 GelNestTM 基质胶包被的平皿里，细胞仍然保持有较好的增殖能力（ki67 阳性）。
DAPI 为细胞染料核（蓝色）；alpha-Tubulin 为细胞骨架蛋白（红色）；ki67 为表达于细胞核中的细胞增殖活性的标志物。标尺为 150 微米。
图 3. 小肠类器官的紧密连接蛋白和上皮细胞特征蛋白的免疫染色结果。
可观察到在 GelNestTM 基质胶中（3D）或者在基质胶薄层上（2D）生长的小肠类器官均能很好的保持生物功能性细胞标志物的表达。
DAPI 为细胞染料核（蓝色）；ZO-1 为细胞紧密连接蛋白标志物（绿色）；CK19 为上皮细胞特征标志物。标尺为 100微米。
图 4.在 GelNestTM 基质胶中生长 6 天的小肠类器官的紧密连接蛋白和上皮细胞特征蛋白的免疫染色结果。
可观察到在 GelNestTM 基质胶中（3D）生长的小肠类器官能很好的保持生物功能性细胞标志物的表达。
DAPI 为细胞染料核（蓝色）；ZO-1 为细胞紧密连接蛋白标志物（绿色）；CK19 为上皮细胞特征标志物。标尺为100 微米。
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#应用指南#
2009 年，Hans Clevers 及其团队利用 Lgr5+ 肠干细胞在体外培养出了三维小肠类器官结构。这种结构反映了肠上皮细胞的生理状况，可进行长期体外培养，同时保持细胞分化能力。这种方法越来越多地用于干细胞研究、疾病模型和再生医学。
小肠类器官既可以用多能干细胞或胚胎干细胞培养，也可以用小肠隐窝干细胞培养。后者由于方便、技术简单、可多次传代，可进行长达两个月的长期体外培养，因此更为常见。
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Part.01 原代小肠组织提取消化
1. 将小鼠安乐死。从回肠末端采集 15 厘米长的肠管。
2. 去除外膜，用冷的 PBS 冲洗。用剪刀剪开肠段，使肠腔朝上。用冰冻 PBS 轻轻清洗剪开的肠段。
3. 在 50 mL 离心管中加入 15 mL 冰冷 PBS。用剪刀将肠管剪成 1~2 mm 的小段，然后用 PBS 冲洗。重复清洗步骤，直至清澈为止。
4. 去除上清液，将组织碎片重悬于 25 mL 肠隐窝消化液（含 2-5mM EDTA）中，冰浴 20 分钟，然后在 20 rpm 旋转床上旋转 30 分钟。去除上清液。
5. 将组织碎片重悬于 10 mL 含有 10% FBS 的冷（2-8℃）PBS 缓冲溶液中。用 70 μm 过滤器过滤上清液，并将滤液装入 50 mL 的干净试管中。重复过滤 3 次，合并滤液。
6. 300×g 离心 5 分钟。弃去上清液。
7. 将沉淀重悬于 10 mL PBS 缓冲溶液中。200×g 离心 3 分钟。除去上清液。如果悬浮液中单细胞过多，请重复离心步骤。
Part.02 小肠隐窝计数筛选与接种
1. 取 10 μL 细胞样本，在显微镜下计数隐窝。200×g 离心 3 分钟，取出上清液。
注：适合培养的隐窝大小不一，通常呈长方形或圆形，边缘相当光滑，看起来像上皮单层的小的折叠部分。绒毛、单细胞或碎屑浓度较高的部分不是类器官培养的理想选择。目标是最大程度地富集合适的隐窝。
2. 将隐窝重悬在肠类器官完全培养基中，每微升培养基含 8-20 个隐窝。制作完全培养基时，加入：
3. 取 150 μL 隐窝悬浮液，与等体积未稀释的 GelNestTM 类器官专用基质胶（NEST 211272）混合，然后轻轻地用移液管上下移动十次，使其充分混合。
4. 将 50 μL 样品加入预热好的 24 孔板的每个孔的中心，形成圆顶状结构。避免形成气泡。
5. 将平板置于 37℃，静置 10 分钟，使基质凝胶凝固。小心处理平板，避免干扰凝胶。
6. 小心地向每个孔中加入 500 μL 室温（15-25℃）类器官培养基，从侧面倒入以避免扰动凝胶。
Part.03 类器官培养与观察
1. 监测类器官的生长。通常，在培养 3 小时左右，隐窝形成球形结构。2-4 天后，类器官开始出芽，到第5-7 天形成复杂结构。
2. 第二天完全更换培养基。小心去除孔边缘的旧培养基，加入 500 μL 新鲜的室温类器官培养基。
3. 定期在倒置显微镜下观察肠类器官并记录。
4. 选择合适的抗体对类器官进行染色，并在荧光显微镜下观察，同时包括适当的特异性对照。
5.使用NEST免费的类器官AI大模型分析软件进行识别批量、无标记分析由显微镜获取的类器官照片（不限显微镜品牌），帮助您更快、更准确的获得类器官的数量、大小（面积）、圆度、周长、灰度值（可统计荧光照片的不同类器官/细胞球的荧光强度，或明场照片的类器官亮度，从而反应类器官的死活状态）等参数，并生成统计分析结果。
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实验结果分析
图 1. 小鼠小肠类器官在 GelNestTM 基质胶中的生长情况。
在第 2 天在 10 倍物镜下，可观察到小型空泡状结构；在第 3 天可观察到明显变大的空泡结构；在第 6 天可观察到具有多个出芽结构的小肠类器官，且培养皿里的类器官可肉眼直接观察到白色颗粒状细胞团。标尺为 200 微米。
图 2. 早期小肠类器官的细胞骨架蛋白和细胞增殖抗原的免疫染色结果。
可观察到在 GelNestTM 基质胶中生长的早期的小肠类器官为单细胞层形成的空泡结构，并且将小肠类器官种在 100 倍稀释的 GelNestTM 基质胶包被的平皿里，细胞仍然保持有较好的增殖能力（ki67 阳性）。
DAPI 为细胞染料核（蓝色）；alpha-Tubulin 为细胞骨架蛋白（红色）；ki67 为表达于细胞核中的细胞增殖活性的标志物。标尺为 150 微米。
图 3. 小肠类器官的紧密连接蛋白和上皮细胞特征蛋白的免疫染色结果。
可观察到在 GelNestTM 基质胶中（3D）或者在基质胶薄层上（2D）生长的小肠类器官均能很好的保持生物功能性细胞标志物的表达。
DAPI 为细胞染料核（蓝色）；ZO-1 为细胞紧密连接蛋白标志物（绿色）；CK19 为上皮细胞特征标志物。标尺为 100微米。
图 4.在 GelNestTM 基质胶中生长 6 天的小肠类器官的紧密连接蛋白和上皮细胞特征蛋白的免疫染色结果。
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