甲藻的超微结构分析
环境样本（此处以甲藻为例）的超微结构分析至今仍具挑战性。本研究证明， 现场实施高压冷冻（HPF）技术能显著保存细胞超微结构， 为后续电子显微镜（EM）分析提供条件，从而获得关于这些海洋生物的新认知。
  浮游生物分析材料与方法
  甲藻采集采用 5 或 10 微米孔径网具在法国滨海自由城湾表层水域慢速拖网 10 分钟。甲板收集后，样品经 Retsch 系列筛网过滤获取 40 微米以下细胞。实验室处理流程为：

1. 通过手动泵抽滤在 1.2 微米混合纤维素酯膜（MERCK）上浓缩；
2. 重悬至终体积约 4 毫升；
3. 1000g 离心 5 分钟。弃上清后，取约 1.2 微升沉淀物装入预先涂覆十六烯（Merck）的金铜 A 型载样台（Leica；深 200 微米，宽 3 毫米），覆盖同样预涂十六烯（Merck）的铝制 B 型载样台（Leica）平面端，使用 Leica EM ICE 进行高压冷冻。

图 1：高压冷冻载样台中的浓缩细胞装载示意图
图 2：A型金载样台（宽 3 毫米，使用面深度为 200 微米）与B型载样台（宽 3 毫米，使用平面侧）。   

冷冻固定样本经过冷冻置换处理（使用 EM AFS2 型号，Leica 公司），程序及溶液如下：在-90°C 的 2%四氧化锇丙酮溶液中保持 60 小时，以 2°C/小时的速率升温 15 小时至-60°C，于-60°C 维持 10 小时，再以相同速率升温 15 小时至-30°C，保持 10 小时后，以最大速率 1 分钟内升温至 0°C，停留 1 小时，随后以最大速率 1 分钟内冷却回-30°C，并用纯丙酮在-30°C 下洗涤 5 次。 

细胞随后逐步渗透 EPON 硬树脂。采用的树脂（不含促进剂）/丙酮（体积比）梯度系列为：25%浓度起始于-30°C，2 小时内升温至-10°C；50%浓度起始于-10°C，以 5°C/小时速率升温 2 小时至+10°C；75%浓度起始于+10°C，以 10°C/小时速率升温 2 小时至+20°C。样本随后在不含促进剂的 100%树脂中分两次渗透，分别为 12 小时和 48 小时。 

随后用含促进剂的 100%树脂进行两次 3 小时和一次过夜的渗透处理，之后在 60°C 下聚合 48 小时。使用超薄切片机（Leica EM UC7）搭配超薄金刚石刀（Diatome）切制 70 纳米薄片。薄片经 1%醋酸铀水溶液染色 20 分钟和柠檬酸铅染色 3 分钟后进行后染色。通过 SerialEM 软件在 JEOL JEM 2100plus 电镜上以 120 千伏电压和 8000 倍放大倍数采集拼图影像。拼图处理采用 Imod 和 Fiji 软件完成。高压冷冻样本处理由海德堡 EMBL 电子核心显微设施（EMCF）完成。
  结果 图 3：按上述方法处理的甲藻显微照片。比例尺=1 µm。
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