PIpetty电动移液器在基孔肯雅病毒核酸检测（实时荧光-PCR）中的应用
  方 案 摘 要：

    本方案聚焦 Pipetty 电动移液器在基孔肯雅病毒核酸实时荧光 - PCR 检测中的应用。该移液器凭借高精度、自动化及防污染设计，在检测各环节发挥关键作用。​在样本前处理与 RNA 提取阶段，微量分液功能提高 RNA 洗脱回收率；PCR 体系配制时，连续分液模式快速分配试剂，防污染吸头避免气溶胶污染；质量控制中，精准移取对照品保证结果可靠。同时，其具备温度补偿功能、能减少人为误差，提升效率与准确性，且维护成本低、合规性强，为检测提供有力支持，保障结果的精准与可重复。

 
  方 案 详 情：

一、实验原理  

    病毒RNA在逆转录酶的作用下产生cDNA，可作为聚合酶链(PCR)扩增反应的模版。TagMan探针实时荧光定量PCR时,在反应体系中加入一对病毒特异性引物和一条荧光基团标记的病毒特异性探针。Tagllan探针的两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团,在探针完好的情况下,报告基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，因而检测不到荧光信号。
    
    在PCR扩增过程中，探针和引物与目标序列结合，当新生链沿着cDNA模板延伸到荧光标记的探针结合位点时，Tag酶发挥5'一3’核酸外切酶的功能，荧光报告基团与淬灭基团分离，荧光基团释放荧光信号。这样模板每扩增一次，就产生一个游离的荧光分子，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板可进行定量分析。其中RNA逆转录过程可以和PCR扩增反应同时进行也可先进行逆转录反应再进行PCR扩增。其他类似机制的荧光探针也可用于核酸检测。



二、‌实验准备

1、设配和材料

 ① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250及配套吸头;
 ② 离心管(1.5 mL、0.2 mL 和 0.1 mL);
 ③ 试管架(5 mL、1.5 mL和 20μL );
 ④ 高速冷冻离心机;
 ⑤ 旋涡混合器;
 ⑥ 荧光定量 PCR 仪等;

 
2，试剂和材料

  ① 病毒核酸提取试剂盒;
 ② 荧光定量 RT-PCR试剂盒;
 ③ 引物及探针等(参考序列下):
CHIKV-FP：5’-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3'
CHIKV-RP：5’-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3’
CHIKV-P：5’-FAMTGCCCACACTGTGA-BHQ1-3’(带下划线的碱基需要 LNA 修饰)。

三、实验步骤

1、病毒 RNA 提取：待检标本用病毒 RNA 提取试剂盒提取，操作步骤按说明书进行，制备的病毒核酸作为 Real-time RT-PCR的模板。
2、配置反应体系

2×RT-PCR 混合液	10	含酶、dNTPs 等基础反应成分
上游引物（10μM）	0.8	特异性结合 CHIKV cDNA 正义链
下游引物（10μM）	0.8	特异性结合 CHIKV cDNA 反义链
荧光探针（10μM）	0.4	结合靶序列，扩增时释放荧光信号
模板 RNA	5	待检测的病毒 RNA（可根据浓度调整）
无 RNA 酶水	3	补足体系至 20μL

 

1. 根据试验要求设置阴性、阳性、内参对照。
2. 根据需要检测的样品数量，配制反应体系，将混合液、引物、探针、水充分混匀后分装，使用Pipetty电动移液器的连续分液模式，设置每次分液量和连续分液次数，每管分液15μL，转移反应管至样品制备区。

 
5、自动更换吸头，设置分液量和分液次数，吸取RNA溶液，在反应管中分别加入5μL RNA ，使每管总体积达到 20μL，记录反应管对应的样品编号。应注意操作过程中，每次操作都更换新的灭菌吸头，严防不同样品间的交叉污染。反应液分装时避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
6、Real-time RT-PCR逆转录和扩增：一步法Real-time RT-PCR检测反应条件为: 42℃ 15 min，95℃ 2min，95℃ 10 s，62℃ 30 s，45 个循环，仪器设置在每一循环 62℃退火/延伸步骤读取荧光信号。该反应条件可根据采用的试剂要求进行适当的调整。

 
 
四、试验结果

1、以荧光 PCR 反应的前 3~15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的 10 倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值(Ct 值)。
2、检测样品的 Ct 值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，可报告样品特异性核酸检测阳性。检测样品的 Ct 值介于 35~45 之间时，属临界区间，建议重复检测。若重复检测结果 Ct 值≥45.0者为阴性；若 Ct值仍介于 35~45 之间，且扩增曲线有明显的指数增长特征者，可报告样品特异性核酸检测阳性。
3、阳性对照的 Ct 值应≤32.0，并出现典型的“S”型扩增曲线；阴性对照 Ct 值应≥45；否则视为实验结果无效，需重复检测。