上期讲述的单重组酶报告基因系统只能依赖一个 Maker 来定位我们的目的细胞，如果没有特定细胞类型特有的基因，则无法通过常规方法对其进行特异性标记。

往期推文：
【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式
【谱系示踪系列第二期】单重组酶介导的多色报告系统方法

但随着细胞分类的不断深入，我们往往需要两个甚至两个以上的 Maker 才能准确定位我们想要研究的细胞群体，并且在一个细胞群中靶向两个基因启动子可能比依赖传统报告系统中常用的单个启动子更精确。这时标记细胞就需要使用到多重组酶介导的遗传方法。

控制由两个启动子驱动的受限制报告基因表达需要两种不同的重组酶系统，例如 Cre-loxP、Flp-frt、Dre-rox 和 Nigri-nox 等。目前已经开发了多种双重组酶介导的遗传标记系统，以增强特异性和同时标记的细胞类型数量，目前常见的可分为交叉报告基因类型、独家报告基因类型和嵌套报告基因类型。

图. 多重组酶介导的基因重组系统^[1]

本期鼠博士为大家讲解多重组酶介导的交叉报告基因类型。

交叉报告基因系统
为了精确标记一个细胞群，有时使用两个细胞特异性 maker 来定义细胞群，例如细胞特异性 makerA 与细胞特异性 makerB 双阳性的细胞（简称为A⁺B⁺ Cell）。如何使用合适的报告基因标记系统，特异性标记这类型细胞呢？这时就需要用到交叉报告基因系统。

交叉报告基因系统用于标记两个 maker 双阳性的细胞类型，根据其标记颜色也可分为单色报告系统与多色报告系统。

单色报告系统
交叉报告基因小鼠与细胞特异性 makerA 的 Cre 鼠、细胞特异性 makerB 的 Dre 鼠进行交配。得到的小鼠体内的两个 maker 双阳性的细胞被标记为单色，其他细胞不被标记上颜色。
 

1 A^-B^- 细胞：
该系统按照启动子的方向，遇到stop序列被终止表达，细胞未被染色。

2 A⁺B^- 细胞：
makerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶会切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 stop 序列被切除），之后，该系统按照启动子的方向，遇到第二个 stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

3 A^-B⁺ 细胞：
makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（第二个 stop 序列被切除），之后，该系统按照启动子的方向，遇到第一个 stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

4 A⁺B⁺ 细胞：
makerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶会切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 stop 序列被切除），makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（第二个 stop 序列被切除），之后，该系统按照启动子的方向，表达红色荧光 tdTomato。

因此，仅A⁺B⁺细胞可被标记为红色。

案例1
下图中就是通过两个细胞特异性标记特异性标记了细支气管肺泡干细胞 （BASC）。BASC 是位于细支气管肺泡管交界处的多能干细胞，它们共同表达细支气管细胞标志物 Scgb1a1（也称为 CC10）和肺泡2型细胞标志物 Sftpc。由于缺乏专门定义 BASCs 的单一最佳标记基因，无法使用传统的 Cre-loxP 介导的谱系追踪方法追逐 BASCs 的分化命运，而通过双标志物就可以特异性地追踪Scgb1a1⁺Sftpc⁺ BASC。

图. 单色交叉报告基因系统^[1]

1 A^-B^- 细胞：
该系统按照启动子的方向，遇到 stop 序列被终止表达，细胞未被染色。

2 A⁺B^- 细胞：
makerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶会切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 stop 序列被切除），之后，该系统按照第一个启动子的方向，表达红色荧光 tdTomato。

3 A^-B⁺ 细胞：
makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（第二个 stop 序列被切除），之后，该系统按照第二个启动子的方向，表达绿色荧光 zsGreen。

4 A⁺B⁺ 细胞：
makerA 介导 Cre 酶表达，Cre 酶会切除两个 loxP 位点之间的序列（第一个 stop 序列被切除），makerB 介导 Dre 酶表达，Dre 酶会切除两个 Rox 位点之间的序列（第二个 stop 序列被切除），之后，该系统按照启动子的方向，表达红色荧光 tdTomato 与绿色荧光 zsGreen，两个蛋白的颜色重叠后，呈现出黄色荧光。

因此，A⁺B^- 细胞被标记为红色；A^-B⁺ 细胞被标记为绿色；A⁺B⁺ 细胞可被标记为黄色。

案例2
如下图中，细支气管细胞标志物 Scgb1a1 阳性的细胞会被标记为红色，肺泡2型细胞标志物 Sftpc 的细胞会被标记成绿色，而双阳性的细支气管肺泡干细胞 （BASC）由于同时表达红色与绿色荧光而被标记为黄色。这样可以通过不同的颜色准确区分不同来源的细胞，增强对细胞群命运可塑性的理解。

图. 多色交叉报告基因系统^[1]