细胞外囊泡（EVs）是细胞释放的纳米级脂质双层结构，携带蛋白质、核酸等生物分子，在细胞间通讯和疾病发展中起关键作用。然而，传统方法难以同时分析EVs的内外蛋白。2022年发表在《ACS Sensors》的研究提出了一种名为EVPIo的高通量多重分析技术，结合抗体微阵列和信号放大策略，成功实现了EVs内外蛋白的同步检测。该研究中， InnoScan 1100 AL 共聚焦微阵列扫描仪作为核心检测设备，为实验数据的获取提供了重要支持。
 
技术原理与工作流程

EVPio技术的核心分为三个步骤： 1. 抗体微阵列捕获EVs：通过喷墨打印技术在醛基化玻片上制备16个抗体微阵列，每个阵列包含10×10的抗体斑点（图1A,1B），靶向EVs表面蛋白（如EpCAM、CD9等）。
  图1:A, B
2. 抗原修复（AR ）与透化处理：优化后的AR条件（90°C PBS处理1分钟）打破了EVs内部蛋白的交叉连接，使其能被抗体识别（图2A）。实验数据显示，AR处理后HSP90（内蛋白）信号提升至51,000 RFU，而EGFR（外蛋白）信号保持相对稳定。  
  图2: A  
3. 多重检测与信号放大：采用寡核苷酸条形码标记的检测抗体和分支DNA扩增技术（图3，A，B, C）。其中，双分支DNA树（4个荧光基团）的信噪比（SNR）与传统的生物素-链霉亲和素法相当（图3D）。   图3.  
InnoScan 的作用：该扫描仪用于荧光信号的定量采集，通过多通道成像（如Alexa Fluor 488、Cy5等）解析不同蛋白的表达水平。HT29 EVs通过InnoScan三色荧光信号（Alexa Fluor 647、Cy3、Alexa Fluor 488nn）同步检测HSP70、CD9和CD63。
 
关键数据与发现
研究以结直肠癌细胞（HT29和SW403）的EVs为模型，通过四种表面蛋白（EpCAM、CD9、CD63、CD81）捕获EVs, 并检测12种内外蛋白的共表达模式（图5）。
 
    图5. 对四种捕获抗体和阴性对照（GFP）所结合的HT29与SW403细胞外囊泡（浓度1.8×10¹⁰颗粒/毫升）进行多重EVPio分析，通过四个独立的三重检测同时分析12种内外蛋白。(A)HT29与(B)SW403囊泡的表型分型结果。SW403的数据以SW403与HT29信号比值呈现，突出两细胞系囊泡差异。内部蛋白标为红色强调。HT29囊泡中CD9⁺亚群总体信号最强，其中ITG α6、CD63、ITG β1和ITG β4为显著检出标志物，HSP70与Alix是最强内部靶点。SW403囊泡的EpCAM⁺亚群中ITG α6、CD9和CD81信号显著更高。灰色数值表示未检测到信号。  
技术优势与局限性
EVPio 技术优势：
1.高通量：单张玻片可分析16个样本，12个指标检测。
2.灵敏度：分支DNA扩增提升了低丰度内蛋白的检出限。
3.灵活性：寡核苷酸条形码避免了抗体物种限制。 局限性：AR处理会降低外蛋白信号，需通进一步实验优化。此外，Cy3通道易受背景干扰，建议改用近红外荧光基团。
 
总结与展望
EVPio技术通过整合抗体微阵列、InnoScan扫描仪和分支DNA扩增，为EVs蛋白组学研究提供了新工具。未来可应用于临床样本分析，例如通过EVs蛋白特征鉴定癌症亚型。研究者计划进一步优化抗原修复条件，并探索与测序技术的联用，以提升多重检测能力。
 
文献原文链接： https://doi.org/10.1021/acssensors.2c01750