在肿瘤研究领域，深入探究肿瘤微环境对于理解肿瘤的生长、转移以及治疗反应至关重要。肿瘤微环境是一个复杂的三维生态系统，包含了恶性癌细胞、血管细胞、免疫细胞和基质细胞等多种细胞类型以及细胞外基质等非细胞组分。这些组分之间的相互作用构成了高度扭曲且形态不规则的血管、致密的细胞外基质沉积、随机分布的免疫细胞以及多区域的缺氧状态。传统二维成像技术难以全面展现这一复杂三维生态系统的真实面貌。

近年来，光学组织透明化与三维荧光显微成像技术的结合为肿瘤微环境的可视化带来了新曙光，但其多维标记能力有限，通常只能在透明化肿瘤组织中定位3或4种细胞和非细胞组分。而近期发表在《Laboratory Investigation》上的研究成果，提出了基于发光二极管（LED）光消融的方法，有望突破这一瓶颈，为深入探究肿瘤微环境的奥秘提供了全新的视角和有力工具，开启肿瘤精准研究与治疗的新篇章，为肿瘤医学的发展带来新的希望。

研究背景与技术挑战
肿瘤微环境的复杂性剖析
肿瘤微环境是一个高度复杂且动态变化的系统，其复杂性体现在细胞类型的多样性以及细胞与非细胞组分之间的相互作用。不同类型的细胞在肿瘤微环境中扮演着不同的角色，共同影响着肿瘤的生物学行为。例如，血管细胞为肿瘤提供营养和氧气，免疫细胞则可能参与肿瘤的免疫监视或免疫逃逸，基质细胞则对肿瘤的结构和功能有着重要的支持作用。这些细胞与细胞外基质等非细胞组分之间的相互作用，构成了肿瘤微环境的独特生态，影响着肿瘤的生长、转移以及对治疗的反应。

三维成像技术的瓶颈与发展需求
尽管光学组织透明化技术与三维荧光显微成像技术的结合为肿瘤微环境的研究提供了有力支持，但目前的三维组织显微镜技术受限于荧光显微镜的成像通道数量以及不同激发和发射波长可用荧光团的种类，使得在三维肿瘤组织中成像的细胞标记数量极为有限。这极大地阻碍了对肿瘤微环境中众多细胞类型的空间分布、相互作用以及动态变化的全面解析，难以满足深入探究肿瘤生物学行为和评估治疗效果的迫切需求。因此，开发一种能够突破这一瓶颈的新技术，实现对肿瘤微环境中多种细胞标记的高分辨率三维可视化，成为了推动肿瘤研究领域发展的重要课题。

技术创新与应用
LED光消融技术的开发与优势
为攻克三维荧光显微成像多维标记能力受限的难题，研究团队开发了一种高功率暖白色发光二极管（LED）光消融方法。通过构建高功率LED光照射装置和温控腔室，能够在不破坏组织和蛋白质抗原完整性的前提下，完全消融透明化肿瘤组织中的荧光信号。这种LED光消融技术具有独特的优势，其高能量光子能够有效穿透整个透明化肿瘤组织，实现对多种荧光信号的全面去除，为后续的多标记染色和成像提供了良好的基础。与传统的荧光和抗体剥离方法相比，LED光消融技术不仅操作简便，而且能够避免化学试剂对组织形态和抗原的潜在损害，为三维多标记成像提供了更加稳定和可靠的实验条件。

循环工作流程的建立与实现
研究人员建立了包含免疫荧光染色、组织透明化、三维共聚焦显微镜成像和 LED光 消融 的循环工作流程。在每个工作周期中，可在整个 400微米厚的小鼠肿瘤宏切片中成像最多4种不同的细胞标记。经过多个工作周期并利用LED光 消融 后，成功在同一个肿瘤宏切片中定位了 8种不同的细胞标记，包括细胞核、血管细胞、免疫细胞以及癌细胞，实现了从组织层面和细胞水平对肿瘤微环境中各类血管、免疫和癌细胞的三维可视化。这一循环工作流程的建立，不仅提高了三维荧光显微成像的多维标记能力，还实现了对肿瘤微环境的全面、动态和高分辨率的可视化，为深入研究肿瘤微环境提供了全新的技术手段。

成像实验与结果分析
动物实验模型的构建与处理
为了验证基于LED光消融的三维多标记荧光显微成像方法在评估癌症免疫疗法方面的应用价值，研究人员将其应用于经过干扰素基因刺激物（STING）激动剂DMXAA处理的小鼠乳腺肿瘤模型。实验中，将TUBO细胞注射到小鼠的乳腺脂肪垫中，待肿瘤长到一定大小后，通过局部注射激动剂对小鼠进行治疗。治疗结束后，收集肿瘤组织样本，进行后续的成像实验。这种动物实验模型的构建，为评估激动剂对肿瘤微环境的影响提供了可靠的实验平台，也为研究免疫疗法的作用机制和效果评估奠定了基础。

三维多标记成像的验证与展示
通过比较经过激动剂治疗的肿瘤与未治疗的对照肿瘤，对肿瘤微环境中的多种细胞类型进行了定量三维空间分析。结果显示，在激动剂处理后的肿瘤中，癌细胞的分布变得不均匀，占细胞区域的比例降至 30%以下，而对照肿瘤广泛分布且占间质的68%以上。同时，与血管相关的血管平滑肌细胞、内皮细胞和纤维母细胞在治疗肿瘤中的相对体积均低于对照肿瘤，这与激动剂诱导的肿瘤血管破坏引发强烈免疫反应的先前报道相一致。

此外，在高分辨率三维图像中，对照肿瘤中大量免疫细胞类型位于间质区域，而在激动剂处理后的肿瘤中，细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的体积百分比显著增加，与CK8+癌细胞相互作用的CTLs体积百分比也大幅上升，表明激动剂治疗增强了肿瘤中CTLs的浸润，并通过CTL介导的免疫反应消除了癌细胞。这些实验结果不仅验证了基于LED光消融的三维多标记成像技术的可行性和有效性，还展示了其在评估免疫疗法效果方面的巨大潜力。

总结与展望
该研究成功开发了一种基于LED光消融的循环工作流程，用于光学透明化肿瘤组织的三维多标记荧光显微成像，为深入探究肿瘤微环境的复杂性和肿瘤对治疗的响应提供了创新性工具。这一方法突破了传统三维荧光显微成像在多维标记能力上的限制，实现了在单个厚肿瘤切片中对多种细胞标记的高分辨率三维可视化和定量空间分析。在临床应用方面，该技术有望为肿瘤的精准诊断和个性化治疗提供更加详细和准确的肿瘤微环境信息，帮助医生制定更加有效的治疗方案。未来，随着光消融时间的进一步缩短和高通量组织处理系统的开发，该技术有望实现对大型体积肿瘤组织的自动化高通量三维多标记成像。这将进一步拓展其在肿瘤研究中的应用范围，推动肿瘤精准医学的发展，为揭示肿瘤微环境的奥秘、发现新的治疗靶点以及优化免疫疗法策略提供更加强大的技术支持，助力科学家们在抗癌道路上不断迈进，为肿瘤患者的精准诊断和个性化治疗带来新的希望。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Zheng J, Wu YC, Phillips EH, CAI X, Wang X, Seung-Young Lee S. Increased Multiplexity in Optical Tissue Clearing-Based Three-Dimensional Immunofluorescence Microscopy of the Tumor Microenvironment by Light-Emitting Diode Photobleaching. Lab Invest. 2024 Jun;104(6):102072.

DOI:10.1016/j.labinv.2024.102072.