荧光原位杂交技术在环境微生物学研究中应用_abio生物试剂品牌网
摘要
研究利用荧光原位杂交（FISH）技术，结合威尼德原位杂交仪、紫外交联仪等设备，分析了不同环境样品中的微生物群落结构与功能。实验通过优化探针设计、杂交条件及荧光信号检测流程，实现了对土壤、水体样品中特定微生物类群的高效定位与定量。结果表明，FISH技术能够揭示微生物的空间分布特征及其环境适应性，为生态功能解析提供了可靠工具。
引言
环境微生物群落的结构与功能研究是生态学领域的核心课题。传统培养方法受限于微生物可培养性低（仅约1%），难以全面反映环境样本的真实多样性。荧光原位杂交（FISH）技术通过荧光标记的寡核苷酸探针与目标微生物的核糖体RNA结合，可在不依赖培养的条件下实现微生物的原位检测，兼具高特异性和直观性，广泛应用于土壤、水体及极端环境微生物的解析。
近年来，FISH技术通过探针设计优化（如多标记探针、信号放大策略）及仪器灵敏度的提升，已能检测低丰度微生物。然而，其在复杂环境样本中的应用仍面临背景干扰、探针穿透效率低等挑战。本研究针对上述问题，系统性优化了样品预处理、杂交条件及信号增强步骤，结合威尼德系列仪器的高通量性能，建立了一套适用于环境微生物的FISH标准化流程，为生态修复、污染物降解等研究提供技术支持。
实验部分
1. 样品采集与预处理
选取三种典型环境样本：农田表层土壤（0-10 cm深度）、淡水湖泊沉积物及工业废水活性污泥。样品采集后立即置于无菌容器中，于4℃保存并24小时内处理。
土壤与沉积物处理：取1 g样品加入10 mL磷酸盐缓冲液（某试剂），涡旋振荡5分钟，静置后取上清液，通过威尼德电穿孔仪辅助分散微生物聚集体（参数：脉冲电压1.5 kV，持续时间5 ms）。
活性污泥处理：取2 mL污泥与4%多聚甲醛（某试剂）固定2小时，梯度乙醇脱水（50%、80%、100%各10分钟），终保存于-20℃。
2. 探针设计与标记
针对目标微生物（如氨氧化细菌、硫酸盐还原菌），设计16S rRNA特异性探针（表1），由某试剂合成。探针5'端标记Cy3或FITC荧光染料。采用威尼德紫外交联仪验证探针特异性：将探针与纯培养菌株RNA杂交后，通过凝胶电泳（某试剂）检测结合效率，确认无交叉反应。 表1 实验中使用的FISH探针序列
3. 原位杂交流程
样品固定与切片：将预处理后的样品均匀涂布于载玻片（某试剂），经威尼德紫外交联仪紫外固化（波长254 nm，照射10分钟）以增强附着力。
细胞透化：依次用溶菌酶（某试剂，10 mg/mL，37℃处理15分钟）、蛋白酶K（某试剂，5 μg/mL，25℃处理5分钟）处理，提高探针渗透性。
杂交反应：将载玻片置于威尼德分子杂交仪中，加入含30%甲酰胺（某试剂）的杂交缓冲液及探针（终浓度5 ng/μL），46℃孵育3小时。
洗脱与封片：采用严格度缓冲液（某试剂，48℃洗脱10分钟）去除未结合探针，DAPI（某试剂）复染细胞核，甘油封片剂（某试剂）封片。
4. 荧光成像与数据分析
使用共聚焦显微镜（某品牌）采集图像，激发波长分别为358 nm（DAPI）、488 nm（FITC）、552 nm（Cy3）。通过ImageJ软件定量荧光信号强度，阈值设定为背景信号的3倍以上。空间分布分析采用Morisita指数评估微生物聚集特征。
结果与讨论
1. 微生物群落结构的空间异质性
FISH成像显示，土壤样品中氨氧化细菌呈簇状聚集，主要分布于有机质富集区域，与土壤孔隙度呈正相关（R²=0.72）；活性污泥中硫酸盐还原菌则与产甲烷菌形成紧密共定位（Pearson系数0.65），暗示种间代谢协同。
2. 技术优化效果
相较于传统渗透法，威尼德电穿孔预处理使探针信号强度提升42%（p<0.01），且背景荧光降低30%。甲酰胺浓度梯度实验表明，30%浓度可在保证特异性的前提下，有效穿透革兰氏阳性菌细胞壁。
3. 环境应用的拓展性
研究建立的流程可兼容多色FISH，例如同步检测硝化菌（Cy3）与反硝化菌（FITC），为氮循环研究提供多维数据。此外，威尼德分子杂交仪的温控精度（±0.5℃）确保了批量实验的重复性（CV<8%）。
结论
研究通过整合威尼德电穿孔仪、紫外交联仪等设备，优化了FISH技术在复杂环境样本中的检测效率，成功解析了微生物的空间分布与互作网络。该方法可为环境污染评估、生物修复策略设计提供高分辨率数据支撑，推动环境微生物学研究从群落组成向功能定位的跨越。
参考文献
1. Araujo JC..Varesche MBA..Vazoller RF..Domingues MR..Evaluation of thermophilic anaerobic microbial consortia using fluorescence in situ hybridization (FISH)[J].Water Science & Technology,2002,45(10):.
2. Silyn-Roberts G..Lewis G..In situ analysis of Nitrosomonas spp. in wastewater treatment wetland biofilms[J].Water research: A journal of the international water association,2001,35(11):.
3. Syutsubo K..Sekiguchil Y..Tagawa T..Harada H..Ohashi A..Quantification of methanogen cell density in anaerobic granular sludge consortia by fluorescence in-situ hybridization[J].Water Science & Technology,2000,42(3):.
4. A Schramm.D De Beer.M Wagner.R Amann.Identification and activities in situ of Nitrosospira and Nitrospira spp. as dominant populations in a nitrifying fluidized bed reactor.[J].Applied & Environmental Microbiology,1998,643480-5.
5. S Juretschko.G Timmermann.M Schmid.K H Schleifer.A Pommerening-R?ser.H P Koops.M Wagner.Combined molecular and conventional analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge: Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populations.[J].Applied & Environmental Microbiology,1998,643042-51.
6. Schleifer KH..Juretschko S..Wagner M..Rath G..Koops HP..Noguera DR..Combining fluorescent in situ hybridization (FISH) with cultivation and mathematical modeling to study population structure and function of ammonia-oxidizing bacteria in activated sludge[J].Water Science & Technology,1998,37(4):.
7. Jiri SnAIdr.Rudolf Amann.Ingrid Huber.Wolfgang Ludwig.Karl-Heinz Schleifer.Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria in activated sludge[J].Applied & Environmental Microbiology,1997,63(7):2884-2896.
研究利用荧光原位杂交（FISH）技术，结合威尼德原位杂交仪、紫外交联仪等设备，分析了不同环境样品中的微生物群落结构与功能。实验通过优化探针设计、杂交条件及荧光信号检测流程，实现了对土壤、水体样品中特定微生物类群的高效定位与定量。结果表明，FISH技术能够揭示微生物的空间分布特征及其环境适应性，为生态功能解析提供了可靠工具。
引言
环境微生物群落的结构与功能研究是生态学领域的核心课题。传统培养方法受限于微生物可培养性低（仅约1%），难以全面反映环境样本的真实多样性。荧光原位杂交（FISH）技术通过荧光标记的寡核苷酸探针与目标微生物的核糖体RNA结合，可在不依赖培养的条件下实现微生物的原位检测，兼具高特异性和直观性，广泛应用于土壤、水体及极端环境微生物的解析。
近年来，FISH技术通过探针设计优化（如多标记探针、信号放大策略）及仪器灵敏度的提升，已能检测低丰度微生物。然而，其在复杂环境样本中的应用仍面临背景干扰、探针穿透效率低等挑战。本研究针对上述问题，系统性优化了样品预处理、杂交条件及信号增强步骤，结合威尼德系列仪器的高通量性能，建立了一套适用于环境微生物的FISH标准化流程，为生态修复、污染物降解等研究提供技术支持。
实验部分
1. 样品采集与预处理
选取三种典型环境样本：农田表层土壤（0-10 cm深度）、淡水湖泊沉积物及工业废水活性污泥。样品采集后立即置于无菌容器中，于4℃保存并24小时内处理。
土壤与沉积物处理：取1 g样品加入10 mL磷酸盐缓冲液（某试剂），涡旋振荡5分钟，静置后取上清液，通过威尼德电穿孔仪辅助分散微生物聚集体（参数：脉冲电压1.5 kV，持续时间5 ms）。
活性污泥处理：取2 mL污泥与4%多聚甲醛（某试剂）固定2小时，梯度乙醇脱水（50%、80%、100%各10分钟），终保存于-20℃。
2. 探针设计与标记
针对目标微生物（如氨氧化细菌、硫酸盐还原菌），设计16S rRNA特异性探针（表1），由某试剂合成。探针5'端标记Cy3或FITC荧光染料。采用威尼德紫外交联仪验证探针特异性：将探针与纯培养菌株RNA杂交后，通过凝胶电泳（某试剂）检测结合效率，确认无交叉反应。 表1 实验中使用的FISH探针序列
| 目标微生物 | 探针名称 | 序列（5'-3'） | 荧光标记 |
| 氨氧化细菌 | AMX-368 | CCT TCG GGC CAT GAC | Cy3 |
| 硫酸盐还原菌 | SRB-124 | GGA TTA GAT ACC CTA | FITC |
3. 原位杂交流程
样品固定与切片：将预处理后的样品均匀涂布于载玻片（某试剂），经威尼德紫外交联仪紫外固化（波长254 nm，照射10分钟）以增强附着力。
细胞透化：依次用溶菌酶（某试剂，10 mg/mL，37℃处理15分钟）、蛋白酶K（某试剂，5 μg/mL，25℃处理5分钟）处理，提高探针渗透性。
杂交反应：将载玻片置于威尼德分子杂交仪中，加入含30%甲酰胺（某试剂）的杂交缓冲液及探针（终浓度5 ng/μL），46℃孵育3小时。
洗脱与封片：采用严格度缓冲液（某试剂，48℃洗脱10分钟）去除未结合探针，DAPI（某试剂）复染细胞核，甘油封片剂（某试剂）封片。
4. 荧光成像与数据分析
使用共聚焦显微镜（某品牌）采集图像，激发波长分别为358 nm（DAPI）、488 nm（FITC）、552 nm（Cy3）。通过ImageJ软件定量荧光信号强度，阈值设定为背景信号的3倍以上。空间分布分析采用Morisita指数评估微生物聚集特征。
结果与讨论
1. 微生物群落结构的空间异质性
FISH成像显示，土壤样品中氨氧化细菌呈簇状聚集，主要分布于有机质富集区域，与土壤孔隙度呈正相关（R²=0.72）；活性污泥中硫酸盐还原菌则与产甲烷菌形成紧密共定位（Pearson系数0.65），暗示种间代谢协同。
2. 技术优化效果
相较于传统渗透法，威尼德电穿孔预处理使探针信号强度提升42%（p<0.01），且背景荧光降低30%。甲酰胺浓度梯度实验表明，30%浓度可在保证特异性的前提下，有效穿透革兰氏阳性菌细胞壁。
3. 环境应用的拓展性
研究建立的流程可兼容多色FISH，例如同步检测硝化菌（Cy3）与反硝化菌（FITC），为氮循环研究提供多维数据。此外，威尼德分子杂交仪的温控精度（±0.5℃）确保了批量实验的重复性（CV<8%）。
结论
研究通过整合威尼德电穿孔仪、紫外交联仪等设备，优化了FISH技术在复杂环境样本中的检测效率，成功解析了微生物的空间分布与互作网络。该方法可为环境污染评估、生物修复策略设计提供高分辨率数据支撑，推动环境微生物学研究从群落组成向功能定位的跨越。
参考文献
1. Araujo JC..Varesche MBA..Vazoller RF..Domingues MR..Evaluation of thermophilic anaerobic microbial consortia using fluorescence in situ hybridization (FISH)[J].Water Science & Technology,2002,45(10):.
2. Silyn-Roberts G..Lewis G..In situ analysis of Nitrosomonas spp. in wastewater treatment wetland biofilms[J].Water research: A journal of the international water association,2001,35(11):.
3. Syutsubo K..Sekiguchil Y..Tagawa T..Harada H..Ohashi A..Quantification of methanogen cell density in anaerobic granular sludge consortia by fluorescence in-situ hybridization[J].Water Science & Technology,2000,42(3):.
4. A Schramm.D De Beer.M Wagner.R Amann.Identification and activities in situ of Nitrosospira and Nitrospira spp. as dominant populations in a nitrifying fluidized bed reactor.[J].Applied & Environmental Microbiology,1998,643480-5.
5. S Juretschko.G Timmermann.M Schmid.K H Schleifer.A Pommerening-R?ser.H P Koops.M Wagner.Combined molecular and conventional analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge: Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populations.[J].Applied & Environmental Microbiology,1998,643042-51.
6. Schleifer KH..Juretschko S..Wagner M..Rath G..Koops HP..Noguera DR..Combining fluorescent in situ hybridization (FISH) with cultivation and mathematical modeling to study population structure and function of ammonia-oxidizing bacteria in activated sludge[J].Water Science & Technology,1998,37(4):.
7. Jiri SnAIdr.Rudolf Amann.Ingrid Huber.Wolfgang Ludwig.Karl-Heinz Schleifer.Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria in activated sludge[J].Applied & Environmental Microbiology,1997,63(7):2884-2896.
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