真核细胞释放到细胞外空间的小泡称为细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）。EV在细胞间和种间通讯及免疫反应中起重要作用。到目前为止，科学界将细胞外囊泡(extracellular vesicle)大致分为三大类：微泡(microvesicle)、凋亡小体(apoptotic body)和外泌体(exosome)。微泡是指由细胞分泌的一种直径为100～1000nm的膜囊泡；凋亡小体是指细胞程序性死亡过程中所释放的一种直径为500～4000nm的膜囊泡。

        外泌体则是一种直径为30～100nm、主要由细胞内多泡体与细胞膜融合并释放到细胞外基质中的膜囊泡，在电镜下表现为脂质双层包裹的扁平球体，呈特征性的杯状外形。许多哺乳动物细胞有释放外泌体的能力，包括网织红细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、肥大细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等。在动物细胞中发现外泌体后，越来越多的证据表明在植物中会出现MVB和类似外泌体的囊泡。这些发现主要集中在细胞生长和分化（包括与细胞壁相关的过程）研究上，或集中在植物对各种胁迫的反应上。

        除了动物体液外，许多植物中也发现含蛋白质和小RNA的外泌体样纳米粒子，如生姜、胡萝卜、西瓜葡萄、橄榄、瓜子。这些植物外泌体由于缺乏毒性，有大规模生产的可能性，其内在特性和携带药物或小RNA分子等其他化合物的可能性，在医疗应用中引起了广泛关注。Regente等于2009年首次发现植物中存在外泌体样小泡，该小泡在向日葵种子中直径为50~200nm。其后许多研究集中于囊泡及其生物活性成分的深层表征，以更好地了解其内在特性和可能的生物技术应用。

图1      植物外泌体

一、植物外泌体的分泌方式和物质构成          植物外泌体与动物外泌体形态结构类似，有磷脂双分子层结构，含有蛋白质和微小RNA，呈茶托状或杯状，其形态可利用透射电子显微镜（TEM）观察。蛋白质分析表明，包含参与信号传递的蛋白质，其中许多蛋白质在应激和免疫反应中被高度诱导；还包含涉及活性氧信号传导和氧化应激反应的蛋白质，及各种膜转运蛋白和囊泡内转运蛋白。植物外泌体含有较丰富的miRNA，其为一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA，在生物体中起重要作用，是一种高效的基因表达调控因子。越来越多研究显示，miRNA不仅在其原始系统内执行生物学功能，还可进行跨界基因表达调控。
二、植物外泌体的分离纯化及鉴定
2.1 植物外泌体的分离纯化
         目前，外泌体的分离方法主要包括超速离心法、蔗糖密度梯度离心法、超滤离心法、免疫亲和法、聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱法和微流控技术。这些分离方法均有各自的优势和局限性。超速离心法和蔗糖密度梯度离心法利用外泌体与其他组分在密度和大小上的差异，通过不同的离心力分离外泌体，操作简单、获得的外泌体数量较多，但工艺费时、回收率不稳定，反复离心可能会对外泌体造成损伤。超滤离心法是基于粒子大小的分离技术，利用超滤膜将外泌体从蛋白质等生物大分子中分离，不影响外泌体的生物活性，但可能损伤外泌体，不能保持其形态。免疫亲和法是基于外泌体表面的受体对其进行分离，能分离所有外泌体或外泌体的选择性亚型，但这种方法成本高，使用条件苛刻，不适于大量样品，且此方法分离的囊泡可能失去原有的功能活性。聚合物沉淀法利用聚合物（如聚乙二醇）劫持水分子，使外泌体溶解度下降，再通过低速离心分离，操作简单、无需专门设备，目前已实现商品化，但提取过程中脂蛋白和聚合物之间可能产生沉淀，导致外泌体纯度降低。尺寸排阻色谱法是基于分离分子的大小和尺寸进行分离，分离纯度高、可保证外泌体的完整性和生物活性，但提取的外泌体浓度低，后续应用需浓缩，且需专业设备。近年，新发展的微流控技术是一种基于外泌体生物化学和物理性质差异的微尺度分离技术，样品处理速度快、成本低、灵敏度高，但产量较低，仅适用于诊断；还有试剂盒提取外泌体，此法操作简单便捷，不需特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高，但市场上各类产品分离纯化效果良莠不齐。

图2      不同植物外泌体提取方法的原理、优缺点

        目前，大多用超速离心法和蔗糖密度梯度离心法提取植物外泌体。Regente等最早从向日葵种子中提取细胞外囊泡。将20g种子中提取的细胞外液通过0.5μm膜过滤，并通过连续离心步骤分别按照步骤10,000g离心30min，40,000g离心60min和100,000g离心60min分级分离。弃去第一个沉淀，将40,000g和100,000g沉淀部分分别重悬在Tris-HCl pH7.5缓冲液中。结果在40,000g部分有较高密度50~200nm囊泡样小泡。Brian等提取拟南芥叶片的细胞外囊泡，将上述方法40,000g离心部分在OptiPrep密度梯度中纯化。Wang等分离柚子的细胞外囊泡，去除果皮，将果肉在高速混合器中于4℃下均化1min。依次将收集的汁液以20,000g离心20min，然后以10,000g离心1h除去碎屑。将纳米囊泡以150,000g沉淀1.5h，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤1次，然后使用蔗糖梯度（分别为8%，30%，45%和60%）纯化和分离。

        综上，植物外泌体的提取方法一般是将待提取部位处理后，先低速离心除去杂质，再高速离心分离外泌体，然后使用密度梯度纯化。根据提取的植物种类、部位及作用目的不同在实验中对提取方法进行调整。

2.2 植物外泌体的鉴定          可使用纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）平台、BCA比色法或Bio-Rad蛋白质定量测定试剂盒，通过比较纳米囊泡计数与蛋白质浓度的比值估算囊泡制剂的纯度；使用电子显微镜检查，观察到外泌体的杯状圆形结构，动态光散射分析其粒径大小约为40~100 nm；流式细胞分析（FACS）进一步证实了所研究囊泡的同源性；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对外泌体进行广泛的蛋白质分析，将其与已知的植物外泌体蛋白质进行比对分析。

        目前，对植物外泌体的鉴定主要是采用电子显微镜观察形态和动态光散射分析粒径分布。动物外泌体已有标记蛋白可确定，但植物外泌体在这方面的研究还不成熟。

三、植物外泌体的功能及应用          植物外泌体作为一个有前途的研究领域的潜力，对人类疾病的治疗具有广泛的意义。其中包括肿瘤治疗、抗菌和调控肠道菌群、抗纤维化、抗病毒、药物递送载体、基因载体等方向。

图3       植物外泌体的生物学功能

3.1 植物外泌体在肿瘤治疗中的作用          目前外泌体在肿瘤方面的研究多聚焦于肿瘤细胞外泌体在肿瘤发生发展中的信息传递作用，从而以特定外泌体作为肿瘤监测的生物标志物，以及以外泌体作为药物载体进行肿瘤细胞靶向治疗。现今植物外泌体对肿瘤细胞生物学行为的影响以及可能的机制也已开展研究，已有研究表明某些植物外泌体对于肿瘤细胞增殖具有抑制作用，探究植物外泌体对肿瘤细胞的影响具有重要的应用价值。Potestà等从药用植物辣木提取物中分离出的辣木外泌体可以通过减少肿瘤细胞BCL2的蛋白表达、降低降低细胞线粒体膜电位从而促进肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞ze增殖，减少肿瘤的发生。miR159是一种植物miRNA。研究发现miR159可在乳腺癌患者血清中检出，并且其丰度水平与乳腺癌的发病率及乳腺癌的进程呈负相关。在体内和离体研究证实通过miR159靶向乳腺肿瘤细胞中编码Wnt信号转录因子的TCF7，降低MYC蛋白水平，抑制Wnt信号信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长增殖。 3.2 植物外泌体抗菌和调控肠道菌群作用          牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis）属于革兰氏阴性厌氧菌的一种，其作为主要病原体可以引起慢性牙周炎。许多致病因子可以由牙龈卟啉单胞菌产生，进而导致牙齿周围的组织降解，引发破坏性免疫反应，最终演变为慢性牙周炎。从生姜中提取的外泌体（gingerexosome-likenanoparticles，GELNs）内含脂质、少量蛋白质、125种以上microRNAs（miRNAs）和大量生物活性物质（6-姜酚和6-姜烯酚）。小鼠实验研究发现生姜外泌体可以选择性结合牙龈卟啉单胞菌表面的血红素结合蛋白35（hemin-bindingprotein35，HBP35）从而影响该菌的生长、附着和迁移，降低该菌的致病性，有效控制慢性牙周炎的发展。

        Crohn’s病和溃疡性结肠炎是临床常见的慢性肠道疾病。Zhang等通过无菌小鼠以及临床实验研究发现生姜外泌体中的小RNA能作用于肠道菌群，对肠道菌群的组成产生影响，可增加乳杆菌和拟杆菌，减少梭菌数量。生姜外泌体与肠道细菌接触被吸收，可以调节细菌某些基因表达和蛋白生成。通过激活AHR（ArylHydrocarbonReceptor）途径诱导IL-22表达使以益生菌作为媒介转导的结肠炎抑制作用得以加强。此外有研究发现生姜所产生的外泌体可以抑制炎性细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达以及增加结抗炎细胞因子（IL-10和IL-22）的表达。此外生姜外泌体还能起到完善肠道屏障的功能。

3.3 植物外泌体的抗纤维化作用          肺损伤后过多的细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）成分（如纤连蛋白，间质胶原，蛋白聚糖和透明质酸）的积累，严重可导致肺纤维化。综合所有对于肺纤维化的治疗方法，其中肺移植的疗效较好，但由于肺源的稀缺，对该方法的应用产生很大的限制。Du等从植物红景天（Rhodiolacrenulata，HJT）中提取的内含HJT-sRNA-m7的外泌体能有效地降低小鼠α平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA），纤连蛋白和Iα1型胶原蛋白（COL1A1）在基因水平和蛋白水平的表达，减轻小鼠肺纤维化，具有良好的抗纤维化作用。 3.4 植物外泌体的抗病毒作用          金银花（Honeysuckle，HS）是中国传统中药材，常用于感冒治疗，现代医学证实其可有效抑制流感病毒复制。周等从金银花水煎液中提取到miRNA2911，对其进行体内和体外的抗病毒实验。在H1N1病毒感染的小鼠实验中，研究人员发现，miRNA2911可有效改善感染流感后所引起的体重降低，提高了小鼠的存活率。在针对其他流感病毒如H5N1和H9N7感染小鼠的实验中，miRNA2911抑制病毒的复制，降低这两种病毒感染的死亡率。体外实验显示miRNA2911能够在体外与甲型流感病毒结合，抑制控制H1N1病毒编码的PB2和NS1蛋白的表达。由于PB2和NS1基因是流感病毒复制所必备的，所以miRNA2911可以有效地抑制流感病毒的复制。 3.5 植物外泌体作为药物传递载体          外泌体作为 30～150nm 的生物纳米级囊泡结构，一方面可携带丰富的蛋白质、RNA、脂类等生物活性分子，是多功能载体，具有在细胞间传递信号的重要作用。另一方面，外泌体天然拥有穿越生物屏障（例如血脑屏障）的能力，还可以迁移到不具备血液供应的的组织或区域，如致密软骨基质。外泌体可以在目标组织区域内停留很长的一段时间。同时对外泌体还可以进行基因工程改造，这是其另一个重要的特征，经过改造之后的外泌体的表面蛋白可以行使很多既定的功能。如：可以在其表面修饰靶向细胞或组织肽，对于特定组织有选择性的靶向针对，使其在其他的器官中数量无法积聚，从而降低全身毒性。外泌体被认为是良好的药物递送载体。 3.6 外泌体作为递送基因载体用于基因治疗          基因疗法通过引入遗传物质来治疗疾病，这让很多之前无法治愈的疾病，如肿瘤、遗传性疾病和自身免疫性疾病的治疗有了不错的疗效，为患者带来了希望。基因治疗中通常使用mRNA和病毒或非病毒质粒DNA作为遗传物质。带负电的核酸难以透过细胞膜，且治疗用遗传物质在体内很脆弱，易于降解或中和，损害基因治疗的效果，因此，遗传物质递送是基因治疗的关键。外泌体作为各种遗传物质的载体对遗传物质进行封装并通过质膜将其递送到细胞中治疗相关疾病，这种方法大大增强疗效以及降低了治疗过程中可能出现的风险。随着人们对于基因编辑技术的研究愈发深入，通过以外泌体载体为基础的靶向基因疗法进行疑难杂症的治疗的应用前景十分广阔。

        由于植物细胞外纳米囊泡的存在仍然存在争议，自2009年Regente等首次从向日葵幼苗分离出并通过透射电子显微镜和蛋白质组学分析证实植物外泌体的存在以来，植物外泌体的研究尤其是在医学方面并不是很多。目前通过实验证实存在外泌体的植物尤其是中药材生姜、胡萝卜、番茄、生姜、金银花、红景天、西兰花、葡萄、水稻、甘草等。这些食源性植物外泌体被证明具有良好的跨物种交流功能。自然界中药用植物繁多，探索其外泌体在疾病治疗中的作用机制手段和用途具有重要的基础与临床研究价值。

四、不同来源的植物外泌体及作用
4.1 生姜          生姜可强化米色脂肪功能，促进代谢，增加机体的胰岛素敏感性。Teng等发现生姜的外泌体样纳米颗粒（gingerexosome-likenanoparticles，GELN）可被肠道细菌摄取，易被乳杆菌吸收，所含的miRNA可直接调控特定细菌的基因表达和代谢物，从而影响菌群组成和宿主生理，增强宿主肠道屏障功能来缓解小鼠的结肠炎。

图4     生姜

        如上文所述，从生姜中提取的外泌体可以选择性结合牙龈卟啉单胞菌表面的血红素结合蛋白35（hemin-bindingprotein35，HBP35）从而影响该菌的生长、附着和迁移，降低该菌的致病性，有效控制慢性牙周炎的发展。另外，生姜外泌体中的小RNA能作用于肠道菌群，对肠道菌群的组成产生影响，可增加乳杆菌和拟杆菌，减少梭菌数量。生姜外泌体与肠道细菌接触被吸收，可以调节细菌某些基因表达和蛋白生成。

4.2 红景天          Du等发现，草药红景天外泌体HJT-sRNA-m7在体外和小鼠肺组织中均能有效地降低纤维化标志基因和蛋白的表达。植物sRNA可通过脂质复合物途径进入人体，为口服sRNA作为治疗药物提供了一种创新的治疗策略。

图5       红景天

4.3 金银花          甲型流感病毒（influenzaAvirus，IAV），特别是H1N1、H5N1和H7N9，对全世界的公共卫生构成了严重威胁。Zhou等在研究中报道了金银花来源的外泌体miRNAMIR2911，在汤剂中高度稳定，连续饮用或灌胃给药可使小鼠外周血和肺组织MIR2911水平显著升高，可靶向多种IAV，包括H1N1、H5N1和H7N9，显著抑制H1N1编码的PB2和NS1蛋白的表达，显著抑制H1N1病毒复制，但对突变病毒感染无影响。MIR2911在体内外均能抑制H5N1和H7N9病毒的复制。值得注意的是，服用MIR2911或金银花汤剂可显著降低H5N1感染引起的小鼠死亡率。MIR2911是中药中第一个直接靶向多种IAV的活性成分，有望成为有效抑制病毒感染的新药。

图6     金银花

4.4 甘草          miRNA通过抑制蛋白编码mRNA的翻译或促进mRNA降解来调节蛋白编码基因的表达。植物miRNA通常是甲基化的，不易降解。甘草干煎剂中含有丰富的miRNA，向静等利用从甘草水煎剂中提取的小分子RNA以及合成的miRNA模拟物（mimic）作用于分离自健康人的外周血单核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）。结果表明，甘草miRNA可通过抑制T细胞分化、炎症和凋亡相关基因的表达而显著调节PBMC，为全面研究甘草的作用机制和发展中药提供了新的思路。

图7    甘草

4.5 葡萄          Ju等发现可从碾碎的葡萄中分离出一种类外泌体纳米颗粒。这些类外泌体，被小鼠食用后，能躲过各种消化酶的水解，最终到达肠道，加快肠道上皮增殖，促进结肠炎的恢复。 4.6 番茄          吴菊萍等采用多步差速离心法和蔗糖密度梯度法优化了番茄外泌体的提取工艺，建立了番茄外泌体负载模型药物和目的基因的纳米药物，考察了细胞的摄取能力。研究结果表明，番茄外泌体构建的纳米药物对细胞无毒，可被细胞摄取并分布于胞浆，其负载基因能有效降低目的基因的表达水平，因此番茄外泌体成为潜在的药物载体。 4.7 向日葵          Regente等首先从向日葵幼苗的细胞外液中分离出细胞外囊泡，通过透射电子显微镜和蛋白质组学分析表征EV，发现这些EV可能富含细胞壁重塑酶和防御蛋白，被植物病原真菌核盘菌吸收。EV具有与真菌细胞相互作用和杀灭真菌细胞的能力，植物EV处理的孢子表现出生长抑制、形态变化和细胞死亡，植物通过EV进行细胞间通讯。 4.8 拟南芥          外泌体是通过运输蛋白质和sRNA在哺乳动物细胞间信号传导中发挥中心作用的EV。众所周知，植物也会产生EV，尤其是对病原体感染的反应。2017年Rutter等发现从拟南芥叶片质外体液提取细胞外囊泡的方法，然后对EV进行蛋白质组分析，发现富集了生物和非生物胁迫应答的相关蛋白。相应地，被丁香假单胞菌感染的植物和水杨酸处理后的植物EV分泌增强。这项发现表明植物EV在植物免疫过程中发挥作用。

图8     拟南芥

五、小结          植物外泌体携带蛋白质、脂质、核酸等，可反映来源细胞的生理、病理情况，在细胞间物质交换和信息传递中发挥重要作用。目前研究的植物外泌体大多来源于可食用的植物或草药，其安全可靠、副作用小，发挥着抗炎、抗病毒、抗纤维化及抗肿瘤等作用。植物外泌体分离提取、鉴定分析成为目前研究的热点。另外，纳米尺寸的植物外泌体也可作为载体携带药物应用于各种疾病的研究。探讨其独特的生物学结构的生物学意义，不仅为各种疾病提供了一种安全经济的治疗选择，也为个体生物学治疗提供了一种靶向性策略，还能为未来药物载体的研发开启一条全新的思路。 参考文献：

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【2】陈春苹,徐红艳,刘帅辰,等.植物类外泌体样纳米颗粒特性,成分与功能研究进展[J].食品与机械, 2024, 40(1):226-233.

【3】帖慧琳,李春磊,王浩然,等.植物外泌体提取及应用研究进展[J].食品与药品, 2020, 22(6):6.

【4】陆麒元,孙雯,齐素华,等. 植物外泌体在医学应用中的研究进展[J]. 养生保健指南,2021(17):293-294.

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