毕赤酵母表达人溶菌酶基因及其活性分析_abio生物试剂品牌网
摘要
利用毕赤酵母表达系统高效表达人溶菌酶基因，通过优化密码子、发酵条件及纯化工艺获得高纯度重组蛋白。采用某品牌SDS-PAGE和Western blot验证表达产物，并通过某品牌酶标仪测定其抗菌活性。结果表明，重组人溶菌酶具有显著的溶菌活性，为工业化生产提供了实验依据。
引言
溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的天然抗菌蛋白，能够水解细菌细胞壁中的肽聚糖，从而发挥抗菌作用。人溶菌酶因其良好的生物相容性和安全性，在医药、食品及化妆品行业具有重要应用价值。然而，天然提取的人溶菌酶产量低、成本高，限制了其大规模应用。
毕赤酵母（PIchia pastoris）作为一种高效的真核表达系统，具有蛋白折叠正确、翻译后修饰完善、发酵密度高等优势，已成为重组蛋白生产的理想宿主。通过优化人溶菌酶基因的密码子，构建重组表达载体，利用毕赤酵母进行高效表达，并对表达产物进行纯化和活性分析，旨在为工业化生产高活性人溶菌酶提供技术支撑。
实验部分
1. 材料与方法
1.1 菌株与载体
实验选用毕赤酵母GS115作为表达宿主，载体选用某品牌pPIC9K质粒。人溶菌酶基因序列经密码子优化后由某试剂公司合成。
1.2 主要试剂与仪器
某品牌限制性内切酶（EcoR I、Not I）
某品牌T4 DNA连接酶
某品牌质粒提取试剂盒
某品牌PCR扩增试剂
某品牌蛋白电泳及Western blot试剂
某品牌酶标仪
威尼德电穿孔仪（用于毕赤酵母转化）
某品牌发酵罐（5 L规模）
2. 实验方法
2.1 表达载体的构建
基因合成与扩增：根据毕赤酵母偏好密码子优化人溶菌酶基因，并引入EcoR I和Not I酶切位点，通过PCR扩增目标片段。
酶切与连接：使用EcoR I和Not I双酶切pPIC9K载体及PCR产物，纯化后通过T4 DNA连接酶进行连接。
转化与筛选：将连接产物转化至某品牌大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含某品牌抗生素的LB平板，筛选阳性克隆并测序验证。
2.2 毕赤酵母转化与筛选
线性化重组质粒：使用Sal I酶切重组质粒，使其线性化。
电穿孔转化：采用威尼德电穿孔仪将线性化质粒导入毕赤酵母GS115感受态细胞，参数设置为1.5 kV，25 μF，200 Ω。
高拷贝转化子筛选：将转化子涂布于含某品牌G418的YPD平板，筛选高抗性克隆，并通过PCR验证整合情况。
2.3 重组菌的诱导表达
种子液培养：将阳性克隆接种于BMGY培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，1%甘油），30℃、250 rpm振荡培养至OD600≈6。
甲醇诱导：离心收集菌体，重悬于BMMY培养基（含0.5%甲醇），每隔24 h补加甲醇至终浓度0.5%，持续诱导96 h。
发酵优化：在5 L发酵罐中采用分批-补料策略，控制溶氧30%、pH 6.0，以提高蛋白产量。
2.4 蛋白纯化
上清液处理：离心收集发酵液上清，经0.45 μm滤膜过滤。
离子交换层析：使用某品牌SP Sepharose FF柱，缓冲液为20 mM磷酸钠（pH 7.0），线性NaCl梯度洗脱。
凝胶过滤层析：进一步纯化采用某品牌Superdex 75柱，缓冲液为PBS（pH 7.4）。
2.5 蛋白检测与活性分析
SDS-PAGE与Western blot：采用某品牌12% SDS-PAGE检测表达产物，转膜后使用抗人溶菌酶抗体进行Western blot验证。
酶活性测定：以Micrococcus lysodeikticus为底物，测定重组溶菌酶在450 nm处的吸光值变化，计算酶活单位。
抗菌实验：采用琼脂扩散法检测重组溶菌酶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果。
结果与分析
1. 重组表达载体的构建
经PCR及测序验证，优化后的人溶菌酶基因成功插入pPIC9K载体，构建了pPIC9K-Lysozyme重组质粒。
2. 毕赤酵母转化与表达
高拷贝转化子经甲醇诱导后，SDS-PAGE显示约14 kDa的特异性条带，与预期人溶菌酶大小一致。Western blot进一步证实了目标蛋白的表达。
3. 发酵优化与纯化
在5 L发酵罐中，通过控制溶氧和pH，蛋白产量达到1.2 g/L。经两步层析纯化后，蛋白纯度>95%。
4. 酶活性分析
重组人溶菌酶比活性为28,000 U/mg，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为15 mm和12 mm，表明其具有良好的抗菌活性。
讨论
研究成功实现了人溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达，并通过优化发酵条件显著提高了产量。纯化后的重组蛋白具有与天然溶菌酶相当的活性，为其工业化生产奠定了基础。未来可进一步优化糖基化修饰，以提高其稳定性和生物活性。
结论
毕赤酵母表达系统可高效生产具有生物活性的重组人溶菌酶，纯化工艺简单且产率高，为大规模应用提供了可行方案。
参考文献
1. 申艳敏;魏建超;尚书文;牛明福;周玉珍;周斌;曹瑞兵;陈溥言;侯继波;人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的高效表达及其活性检测[J];微生物学通报;2008年04期
2. 何金花;刘誉;刘冠杰;李琳娜;李海成;王丽娟;溶菌酶在医药中的应用及其研究进展[J];今日药学;2008年02期
3. 孙怀昌,张泉,施伟庆,李国才,于峰人溶菌酶cDNA的克隆及其在小鼠体内的表达[J];中国兽医学报;2004年02期
4. 王颖,郝彦玲,罗云波人溶菌酶基因的克隆及其在真核菌株中表达质粒pPIC9K/hLZM的构建[J];农业生物技术学报;2004年04期
5. 雷连成,韩文瑜,乔红伟大肠杆菌耐药性中药抑制剂的初步研究[J];吉林农业大学学报;2003年04期
6. 于政权,樊宝良,戴蕴平,郑敏,牛慧玲,王美丽,王丽丽,费菁,李宁转基因小鼠乳腺表达重组人溶菌酶[J];科学通报;2003年20期
7. 矫庆华,钱世钧,叶军,郭伟人工合成人溶菌酶基因在大肠杆菌中表达[J];生物工程学报;1997年01期
利用毕赤酵母表达系统高效表达人溶菌酶基因，通过优化密码子、发酵条件及纯化工艺获得高纯度重组蛋白。采用某品牌SDS-PAGE和Western blot验证表达产物，并通过某品牌酶标仪测定其抗菌活性。结果表明，重组人溶菌酶具有显著的溶菌活性，为工业化生产提供了实验依据。
引言
溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的天然抗菌蛋白，能够水解细菌细胞壁中的肽聚糖，从而发挥抗菌作用。人溶菌酶因其良好的生物相容性和安全性，在医药、食品及化妆品行业具有重要应用价值。然而，天然提取的人溶菌酶产量低、成本高，限制了其大规模应用。
毕赤酵母（PIchia pastoris）作为一种高效的真核表达系统，具有蛋白折叠正确、翻译后修饰完善、发酵密度高等优势，已成为重组蛋白生产的理想宿主。通过优化人溶菌酶基因的密码子，构建重组表达载体，利用毕赤酵母进行高效表达，并对表达产物进行纯化和活性分析，旨在为工业化生产高活性人溶菌酶提供技术支撑。
实验部分
1. 材料与方法
1.1 菌株与载体
实验选用毕赤酵母GS115作为表达宿主，载体选用某品牌pPIC9K质粒。人溶菌酶基因序列经密码子优化后由某试剂公司合成。
1.2 主要试剂与仪器
某品牌限制性内切酶（EcoR I、Not I）
某品牌T4 DNA连接酶
某品牌质粒提取试剂盒
某品牌PCR扩增试剂
某品牌蛋白电泳及Western blot试剂
某品牌酶标仪
威尼德电穿孔仪（用于毕赤酵母转化）
某品牌发酵罐（5 L规模）
2. 实验方法
2.1 表达载体的构建
基因合成与扩增：根据毕赤酵母偏好密码子优化人溶菌酶基因，并引入EcoR I和Not I酶切位点，通过PCR扩增目标片段。
酶切与连接：使用EcoR I和Not I双酶切pPIC9K载体及PCR产物，纯化后通过T4 DNA连接酶进行连接。
转化与筛选：将连接产物转化至某品牌大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含某品牌抗生素的LB平板，筛选阳性克隆并测序验证。
2.2 毕赤酵母转化与筛选
线性化重组质粒：使用Sal I酶切重组质粒，使其线性化。
电穿孔转化：采用威尼德电穿孔仪将线性化质粒导入毕赤酵母GS115感受态细胞，参数设置为1.5 kV，25 μF，200 Ω。
高拷贝转化子筛选：将转化子涂布于含某品牌G418的YPD平板，筛选高抗性克隆，并通过PCR验证整合情况。
2.3 重组菌的诱导表达
种子液培养：将阳性克隆接种于BMGY培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，1%甘油），30℃、250 rpm振荡培养至OD600≈6。
甲醇诱导：离心收集菌体，重悬于BMMY培养基（含0.5%甲醇），每隔24 h补加甲醇至终浓度0.5%，持续诱导96 h。
发酵优化：在5 L发酵罐中采用分批-补料策略，控制溶氧30%、pH 6.0，以提高蛋白产量。
2.4 蛋白纯化
上清液处理：离心收集发酵液上清，经0.45 μm滤膜过滤。
离子交换层析：使用某品牌SP Sepharose FF柱，缓冲液为20 mM磷酸钠（pH 7.0），线性NaCl梯度洗脱。
凝胶过滤层析：进一步纯化采用某品牌Superdex 75柱，缓冲液为PBS（pH 7.4）。
2.5 蛋白检测与活性分析
SDS-PAGE与Western blot：采用某品牌12% SDS-PAGE检测表达产物，转膜后使用抗人溶菌酶抗体进行Western blot验证。
酶活性测定：以Micrococcus lysodeikticus为底物，测定重组溶菌酶在450 nm处的吸光值变化，计算酶活单位。
抗菌实验：采用琼脂扩散法检测重组溶菌酶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果。
结果与分析
1. 重组表达载体的构建
经PCR及测序验证，优化后的人溶菌酶基因成功插入pPIC9K载体，构建了pPIC9K-Lysozyme重组质粒。
2. 毕赤酵母转化与表达
高拷贝转化子经甲醇诱导后，SDS-PAGE显示约14 kDa的特异性条带，与预期人溶菌酶大小一致。Western blot进一步证实了目标蛋白的表达。
3. 发酵优化与纯化
在5 L发酵罐中，通过控制溶氧和pH，蛋白产量达到1.2 g/L。经两步层析纯化后，蛋白纯度>95%。
4. 酶活性分析
重组人溶菌酶比活性为28,000 U/mg，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为15 mm和12 mm，表明其具有良好的抗菌活性。
讨论
研究成功实现了人溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达，并通过优化发酵条件显著提高了产量。纯化后的重组蛋白具有与天然溶菌酶相当的活性，为其工业化生产奠定了基础。未来可进一步优化糖基化修饰，以提高其稳定性和生物活性。
结论
毕赤酵母表达系统可高效生产具有生物活性的重组人溶菌酶，纯化工艺简单且产率高，为大规模应用提供了可行方案。
参考文献
1. 申艳敏;魏建超;尚书文;牛明福;周玉珍;周斌;曹瑞兵;陈溥言;侯继波;人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的高效表达及其活性检测[J];微生物学通报;2008年04期
2. 何金花;刘誉;刘冠杰;李琳娜;李海成;王丽娟;溶菌酶在医药中的应用及其研究进展[J];今日药学;2008年02期
3. 孙怀昌,张泉,施伟庆,李国才,于峰人溶菌酶cDNA的克隆及其在小鼠体内的表达[J];中国兽医学报;2004年02期
4. 王颖,郝彦玲,罗云波人溶菌酶基因的克隆及其在真核菌株中表达质粒pPIC9K/hLZM的构建[J];农业生物技术学报;2004年04期
5. 雷连成,韩文瑜,乔红伟大肠杆菌耐药性中药抑制剂的初步研究[J];吉林农业大学学报;2003年04期
6. 于政权,樊宝良,戴蕴平,郑敏,牛慧玲,王美丽,王丽丽,费菁,李宁转基因小鼠乳腺表达重组人溶菌酶[J];科学通报;2003年20期
7. 矫庆华,钱世钧,叶军,郭伟人工合成人溶菌酶基因在大肠杆菌中表达[J];生物工程学报;1997年01期
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