胰腺导管腺癌（PDAC）是美国癌症死亡的第三大原因，为PDAC患者寻求新颖有效的治疗方法是一个首要问题。由于PDAC肿瘤微环境中缺乏效应T细胞，PDAC的免疫疗法受到阻碍。鉴定免疫原性肿瘤相关抗原（TAA）和肿瘤特异性抗原（TSA）能够克服PDAC对免疫疗法耐药性，从而开发个性化的癌症疫苗和T细胞疗法。与TAA相比，TSA新抗原因其在肿瘤组织特异性表达、在正常组织中的缺失以及在建立中心耐受的髓质胸腺上皮细胞（mTEC）中缺乏表达而提高的免疫原性，具有更好的治疗前景。在新抗原表位预测的方法选择中，质谱法（MS）相比于外显子测序（WES），能够检测到基因突变外的多种新抗原，如翻译后修饰、有缺陷的核糖体产物（DRiP）、蛋白酶体剪接和其他非基因组改变。

2025年，来自约翰斯·霍普金斯大学医学院的团队在CLINICAL CANCER RESEARCH发表了题为“Comparison of Shared Class I HLA-Bound Noncanonical NeoePItopes between Normal and Neoplastic Tissues of Pancreatic Adenocarcinoma”的文章。在本研究中，作者采用MS分析方法来比较同一患者的PDAC组织及其相应正常组织的免疫肽组，鉴定了来源于典型蛋白的单氨基酸替代的HLA I型肽段，这些肽段氨基酸改变不是由基因组突变引起的，最有可能是由涉及tRNA氨基酸误酰化的翻译错误引起的，并且肽段在多个患者间共享，可能成为非典型的共享新抗原。研究结果为开发更安全、更有效的PDAC新抗原治疗方法铺平了道路。

1、PDAC肿瘤组织中HLA-I型突变肽段鉴定

为了了解天然HLA I类限制性T细胞表位是否可以携带氨基酸突变，使用之前开发的基于质谱的技术从四个人类PDAC组织样本中建立了新的HLA I类免疫肽组。将肽长度缩小到8到11个氨基酸，我们分别从PDAC#1、2、3和4中鉴定出2358、1015、1040和1067条独特的肽（图1A）。其中，分别有631条（25.68%）、283条（27.88%）、311条（29.90%）和278条（25.65%）肽携带单个氨基酸突变（图1A）。根据WES，通过将这些肽序列突变与体细胞错义突变进行比较，发现没有一种突变是由体细胞突变引起的，这表明产生这些肽段的氨基酸突变涉及其他机制。经过亲和力预测、人类蛋白图谱分析、T2结合实验，筛选得到3条突变肽段：PTPRZ1S1102K、CHD9A2174R、PSMB5K66V。通过荧光标记实验进一步预测免疫原性，其中PTPRZ1S1102K能够引发强烈的免疫原性应答。

图1.从患者PDAC肿瘤样本中鉴定具有单氨基酸突变的免疫原性HLA I型肽段

2、同一患者PDAC肿瘤和正常组织中HLA I型突变肽段鉴定

作者提取并比较了15名患者的16对PDAC肿瘤和正常组织的免疫肽组，其中9例为原发性肿瘤，与正常胰腺配对；七对是转移性肿瘤（两对来自肺部，五对来自肝脏）。从正常组织中的7885个独特源蛋白中鉴定出10822条8-11mer肽，从肿瘤组织中的5930个独特源蛋白中鉴定出8094条8-11mer肽（图2C）。从正常组织中的3881个独特源蛋白中鉴定出4151条8-11mer突变肽，从肿瘤组织中的3473个独特源蛋白质中鉴定出3669条8-11mer突变肽（图2D）。

图2.从患者PDAC肿瘤和正常组织中鉴定HLA I型肽段

3、PDAC肿瘤特异性突变肽在多个患者中共享

作者比较了16对样本肿瘤和正常组织的免疫肽组，发现65.3%的野生型肽段和92.5%的突变肽段是肿瘤组织特有的，并且分析表明野生型和突变型肽段在肿瘤组织中更为丰富。

随后，作者比较了原发性PDAC或转移性PDAC中的肿瘤特异性免疫肽组，以鉴定肿瘤共享抗原。在原发性PDAC标本中，3个或多个PDAC之间共享了6条突变肽。9名患者共享1条突变肽（ETALVELVK；白蛋白E550Q）。然而，由于该蛋白质普遍表达，治疗靶点价值有限，未进一步研究。在转移性PDAC标本中，2条突变肽段在3个或多个PDAC之间共享。

图3. 肿瘤特异性HLA I型野生肽段和突变肽段

4、HLA I型突变肽段中的氨基酸替代模式

作者总结了正常或肿瘤组织特异性突变肽段常见氨基酸替代的前10名，其中，Q-E（正常组织20.44%；肿瘤组织24.59%）、N-D（正常组织23.56%；肿瘤组织19.89%）和V-L（正常组织11.33%；肿瘤组织16.85%）是肿瘤和正常组织特异性突变肽段最常见的三种氨基酸替代（图4A和B）。尽管肿瘤和正常组织特异性突变肽段的前3名AA替代是相同的，但是有几种氨基酸替代形式是仅在肿瘤组织中出现的（A-P、R-K、L-A、P-K）（图4B）。

那么肿瘤特异性AA替代是否会影响突变肽的免疫原性。实验结果表明41个正常组织特异性AA突变和45个肿瘤特异性AA突变能增加与HLA的亲和力，肿瘤组织中这些肽段可能有更高的免疫原性，应作为免疫治疗靶点进行进一步研究。有趣的是，一些AA替代显著降低了肽段和HLA的结合亲和力，这些低亲和力的肽段可能会导致免疫逃逸。

图4.正常和肿瘤特异性肽段氨基酸替代模式

5、突变肽段与HLA结合亲和力改变的结构基础

为了了解突变肽段与HLA的结合亲和力为何增加，作者对与相应HLA I类分子HLA-a*33:01复合的正常和新表位肌动蛋白肽进行了分子建模，使用AlphaFold来预测结构。野生型肌动蛋白肽的预测结合亲和力为2.8μmol/L，其突变肽段的预测结合亲和性要高得多，为0.5μmol/L。在突变肽段中，Q1的侧链酰胺氮与G2羰基的羰基形成氢键。这种新的氢键在正常肽段中是不存在的，可能是突变肽段结合亲和力增加的原因。

这是第一项比较同一患者肿瘤和正常组织免疫肽的研究。鉴定的单个氨基酸突变的HLA I型免疫肽不是由基因组突变引起的，最有可能是由涉及tRNA氨基酸误酰化的翻译错误引起的。由于这些突变肽在个体患者中具有很高的肿瘤特异性，并在多个患者中共享，因此是疫苗和T细胞治疗开发的新抗原候选者。