在以往推文中，我们详细介绍了 PCR 实验的基础与进阶技巧，解答了许多实验中常见的问题及解决方案。今天，我们将深入探索 qPCR 的两位“隐形英雄”：熔解曲线和 Ct 值。它们看似“低调”，却往往是分析实验结果的关键因素。让我们一同揭开它们的的神秘面纱，聊聊 qPCR 的那些事儿！ 

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qPCR 快速回顾

qPCR 是什么?

实时荧光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR，qPCR) 可实时监测  DNA 扩增过程中的荧光信号，以实现对起始模板的定量分析。通过在  PCR 反应体系中引入荧光探针或染料，使得每个扩增循环中产生的荧光信号可以被实时检测，从而反映出扩增产物的量^[1]。

简单来说，它就像 DNA 扩增界的“股票走势分析师”，实时告诉你扩增了多少，何时到达“拐点” (Ct 值)。

图 1. qPCR 流程图^[1]。

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小贴士

SYBR Green 和 TaqMan 是实时荧光定量 PCR (qPCR) 中两种常用的检测探针，各自具有不同的优缺点。以下是这两种方法的对比：

qPCR 结果分析: 三大核心指标
• 扩增曲线 (Amplification Curve)：评估反应效率的重要工具，确保实验结果的科学性和可靠性。
• Ct 值 (Cycle Threshold)：反应样品中靶标 DNA 的初始量，Ct 值越小，说明样品中靶标 DNA 的初始量越多。
• 熔解曲线 (Melting Curve)：验证特异性的小助手，判断是否有非特异扩增或引物二聚体。

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扩增曲线:
揭示 PCR 反应的动态过程

扩增曲线: PCR 实验的“成长轨迹”

扩增曲线 (Amplification curve) 是指随 PCR 反应进行，根据荧光信号强度随着循环数变化而绘制的曲线。

图 2. qPCR 扩增曲线示意图。

正常的扩增曲线 (S 型) 包括四大“黄金阶段”：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。

• 基线期：“热身阶段”，通常出现在反应的前 3 - 15 个循环内。这一阶段仪器会聪明地根据这段“无声无息”的信号计算出基线范围，为后续的“精彩瞬间”埋下伏笔。

• 指数增长期：PCR 反应的“高潮时刻”，是扩增曲线快速上升的阶段。所有试剂都“活跃”了，DNA 聚合酶就像赛车手，快速合成，反应也达到了最佳效率——这就是“指数”的威力！这一阶段是做定量分析的最佳时期，PCR 产物量和初始模板量质检几乎可以画出一条完美的直线。

• 线性增长期：PCR 反应进入“疲软期”。随着原料逐渐耗尽，DNA 聚合酶开始“累了”，反应效率逐渐降低，荧光信号的增长速度慢慢放缓，产物量和初始模板量之间的指数关系开始变得不那么“准确”。

• 平台期：PCR 反应到达“终点站”，这一阶段荧光信号基本停滞不前，趋于平稳，扩增就此“画上句号”。不同反应进入平台期的时间和信号高低不同，反应的“完结”也各有差异。

扩增曲线分析:
你的扩增曲线是“黄金路线”还是“问题频发”

 
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Ct 值: 解锁你的定量密码

Ct 值: PCR 实验的“拐点时刻”

Ct 值，全称为 Cycle Threshold，即在 PCR 反应中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

简单来说，Ct 值指在 PCR 反应中的荧光信号突破了“背景噪音”，开始呈指数级上升时，对应的那个“拐点”所处的循环次数，它告诉我们“什么时候开始有戏了”。总结一句话，Ct 值就像是 PCR 实验中的“开场白”，它告诉你“什么时候开始精彩”！

Ct 值的范围

Ct 值和起始模板量之间的关系就像参加跑步比赛，起跑线距离终点的远近决定了跨越终点的时间。简单来说，起始模板量越多，PCR 反应越快，Ct 值就越小；而起始模板量越少，反应就会慢一些，Ct 值自然就会更大。

 
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熔解曲线:
一眼看穿“真假扩增”

熔解曲线: DNA 的“解密时刻”

通过逐步提高温度同时监测每个温度点的荧光信号变化，最终生成一条“熔解曲线” (Melting Curve)。随着温度上升，DNA 双链结构开始解开，荧光信号从双链中释放出来，荧光信号下降，最终升高到 DNA 双链解开 50% 的温度即为溶解温度 (Tm)，是 DNA 解锁的关键温度。

熔解曲线听起来像是 DNA 在做一场高温的“脱单”大典！它揭示了随着温度升高，DNA 双螺旋结构逐渐分开变成“单链情人”的过程，用于分析 PCR 产物的浓度、特点及纯度。

图 3. qPCR 熔解曲线示意图。

熔解曲线分析:
你的熔解曲线是“好演员”还是“草台班子”?

 
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小结

qPCR 实验中，Ct 值帮你量化基因表达，熔解曲线帮你验证特异性。强强联合堪称 qPCR 实验成功的“黄金搭档”。所以，下次当你看到漂亮的 Ct 值和干净的熔解曲线时，不妨给自己点个赞！

关注我们，带你玩转分子生物学的每一个细节，实验成功就是这么简单！欢迎留言分享，让我们一起成为 qPCR 实验的高手。
 

[1] Grace Adams. A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. Biochem (Lond) 22 June 2020; 42 (3): 48–53.