细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞释放的异质性膜颗粒家族，为多种生理过程及疾病研究提供关键信息。深入研究EVs需对其精确表征，然而其异质性、尺寸不均一性、折射指数及复杂性使其分析极具挑战。

一起来看下具备优秀灵敏度和分辨率的4激光6色的CytoFLEX nano纳米流式分析仪是如何应对的：

CytoFLEX nano纳米流式分析仪通过405 nm激光激发侧向散射光可检测小至40纳米的颗粒，六色荧光检测通道提供更优的灵敏度与分辨率。
以下研究采用5色组合方案，对乏血小板血浆（PPP）样本中的EVs亚群进行免疫表型表征。

方法

乏血小板血浆（PPP）细胞外囊泡制备流程如下：

1 取3 mL新鲜人全血，200 xg离心5分钟；
2 吸取上层血浆1 mL，经200 nm注射器过滤器初滤后，采用iZON qEV 70 nm尺寸排阻色谱柱（SEC）纯化PPP；
3 筛选特定组分分别进行单色及多色染色用于免疫分型；
4 所选PPP组分使用以下抗体标记：CD81 PB、CD9 FITC、CD63 APC、CD61 PC7、CD235a PE；
5 样本经CytoFLEX nano纳米流式分析仪检测，数据通过CytExpert for nano软件分析。

实验结果

图1：对聚集体的检测

图2：样本稀释优化方案-非群集条件与稳定MdFI

（经筛选确定样本稀释度，确保满足：1. 非群集状态（<6000 eps）；2. 事件收集率100%；3. 稀释梯度内MdFI稳定性）

图3：目标组分筛选结果

（选定粒径分布最宽的组分5）

图4：五色抗体组合的单色质控策略

（执行单色对照实验以计算荧光补偿）

图5：五色抗体组合荧光补偿校正及亚群分析策略

（CytExpert nano软件精准补偿；通过设门鉴定：1. 红细胞阴性EVs；2. 血小板源性EVs；3. 非血小板源性EVs）

设门策略分步解析

1 单颗粒群圈定；
2 排除CD235+事件（疑似聚集体）；
3 在CD235-群体中鉴定CD61+（血小板源性EVs）和CD61-；
4 进一步区分：CD9+亚群和CD9-亚群；
5 在以上亚群中鉴定CD81+和CD63+。

图6：特征性EVs亚群鉴定
（设门策略示例图示）

结论
基于iZON qEV 70 nm色谱柱收集组分的粒径分布与荧光染色特征，本研究成功定位细胞外囊泡（EVs）富集组分。CytoFLEX nano纳米流式分析仪可检测单个PPP-EV颗粒上多种荧光信号（包括PB、FITC、PE、PC7及APC）。

实验证实：
在优化抗体浓度并设置合理对照条件下，可有效规避抗体聚集体及背景干扰；同时CytoFLEX nano纳米流式分析仪能实现不同荧光染料间的溢漏补偿校正，确保五色标记同步分析，最终通过免疫表型染色成功鉴定多个EVs亚群。