组织再生进展的原位监测对基础医学研究和临床转化具有重要意义。尽管在组织工程和再生医学领域取得了重大进展，但很少有技术能够原位监测组织的再生过程。 团队和上海市第六人民医院骨科合作提出了一种集成的第二近红外（NIR-II, 1000-1700 nm）窗口活体成像策略，该策略基于3D打印的掺杂NIR-II镧系比率型纳米探针的生物活性玻璃支架，用以原位监测小鼠颅骨修复过程中的早期炎症反应、血管生成和植入物降解过程。 该研究成果于2022年1月10日以“NIR-II Ratiometric Lanthanide-Dye Hybrid Nanoprobes Doped Bioscaffolds for In Situ Bone RepAIr Monitoring”为题在线发表于《纳米·快报》(Nano Letters, 2022, 22, 783-791)。

        骨修复是最复杂的生物学过程之一，其中包括细胞增殖、分化和组织形态变化等过程，大致可分为三个相互重叠的阶段：炎症反应、血管生成和骨重塑。整个骨修复周期通常需要几个月甚至几年，同时伴随着植入物的降解，最终实现新生骨的正常形态和生物功能性。在临床上，医生需要对骨修复患者的每个阶段进行及时诊断和医疗干预，才能获得理想的治疗效果。然而，超声、CT、MRI和PET成像等传统医学检测方法难以实时报告骨修复的整个进程，并且存在放射性等限制。因此，能够原位监测骨修复过程中的炎症反应、血管生成和植入物降解对于基础医学研究和临床转化具有重要意义。
        荧光成像因其无辐射、高灵敏和高时空分辨等特点在生物医学领域中具有极大的应用潜力。利用荧光成像技术能够可视化细胞水平和活体水平的生理活动，从而监测和了解生物功能和病理过程。然而，当前报道的大多数荧光探针的发射波长较短(<900 nm)，限制了其在深组织中的成像质量和特异性，并且这些常规探针通常基于绝对强度依赖的信号读出，然而活体组织对光的吸收和散射影像通常会导致荧光信号的波动，最终导致检测结果产生较大的误差。相比之下，比率型荧光传感器可以通过信号强度的自校准来减少非特异性影响，从而实现可靠的高灵敏检测效果。
鉴于此，研究团队提出了一种基于3D打印生物活性玻璃支架的集成活体荧光成像策略：选用具有优异生物相容性的生物活性玻璃（BG）作为支架的基质材料，以具有近红外二区发光性质的稀土纳米颗粒（ErNPs）作为发光核，通过3D打印技术制备得到ErBG支架，并在支架表面修饰HClO响应的荧光染料（IR808）作为响应基团，最终构建得到了近红外二区比率荧光生物支架（ErBG@IR808）。将支架植入到小鼠颅骨缺损模型，实现了原位监测骨修复过程中的早期炎症反应、血管生成和植入物降解情况。

图1. 构建近红外二区比率荧光生物支架用于原位监测骨修复过程示意图
        团队构建了小鼠颅骨缺损模型，并将ErBG@IR808支架植入到缺损部位。研究结果显示，由于NIR-II窗口具有深组织穿透和低组织散射的特点，无需任何侵入性操作就可以实时监测到支架在活体中的荧光信号。更为重要的是，通过比率荧光成像可以避免组织肿胀所引起的荧光信号波动，从而准确监测骨修复过程中的炎症过程，并且与临床上血常规检测结果高度一致。
图2.（a）活体监测骨修复过程中炎症反应示意图；（b）支架在骨缺损部位的比率荧光成像照片；（c）808 nm和980 nm通道的荧光信号变化；（d）比率荧光信号变化；（e）血常规结果
        为检测骨修复过程中血管生长情况，研究团队通过静脉注射NIR-II小分子探针LZ1105与ErBG@IR808支架的近红外二区荧光信号进行共同定位。结果表明，在支架植入后的第1天，颅骨缺损部位没有明显血管生成；在21天时，可以观察到大量新生血管沿着支架空隙生长；观察期至90天时，发现新生血管继续形成并扩散至整个骨缺损区。更为重要的是，通过活体荧光定量分析计算不同时间点的新生血管数量，与传统离体样本CT分析结果相一致。此外，支架的NIR-II荧光信号可在体长达12周的时间内，原位监测支架的降解情况。

图3.（a）活体监测骨修复过程中血管生长示意图；（b，c）骨缺损部位新生血管的荧光成像照片和统计分析；（d，e）骨缺损部位新生血管的micro-CT成像照片和统计分析；（f）VEGF表达情况。
        最后，研究团队对ErBG@IR808支架的活体成骨性能进行了分析。结果显示，BG和ErBG@IR808支架上分布有明显的新生骨组织，并且ErBG@IR808支架可以促进血管生长和新骨形成，加速骨缺损修复。此外，H&E染色结果显示，支架在植入后12周内对小鼠的心、肝、脾、肺和肾等器官没有损伤，表明ErBG@IR808支架在长期监测骨修复进展中具有良好的活体生物相容性。未来，这种集成的NIR-II荧光成像策略还可以进一步拓展到原位监测血管、神经等组织工程的进程，以及可植入医疗器械与宿主的免疫反应。

图4.（a）离体骨缺损样本的光学照片和荧光照片；（b，c）Micro-CT照片和新生骨统计分析；（d）新生骨组织的连续荧光标记照片；（e）Masson染色；（f）对OCN免疫组化染色。

        该工作得到了复旦大学化学系、聚合物工程国家重点实验室、上海市分子催化和功能材料重点实验室、国家重点研发项目、国家自然科学基金委员会、上海市科学技术委员会等机构与项目的大力支持。

参考文献
Peng Pei#, Hongxing Hu#, Ying Chen#, Shangfeng Wang, Jing Chen, Jiang Ming, Yiwei Yang, Caixia Sun, Shichang Zhao*and Fan Zhang*.NIR-II Ratiometric Lanthanide-Dye Hybrid Nanoprobes Doped Bioscaffolds for In Situ Bone Repair Monitoring. Nano Lett., 2022, 2, 783-791.


| 仪器选型  
近红外二区小动物活体成像系统NIR-II-ST
NIR-II in vivo imaging system
           近年来，近红外二区成像（NIR-II，1000-1700nm）已成为活体成像研究领域内的热点，相对于传统的可见光（VIS，400-700nm）以及近红外一区（NIR-I，700-900nm），NIR-II光具有更好的组织穿透性和更高的空间分辨率。文中利用近红外二区小动物活体成像系统
NIR-II-ST完成了原位监测骨修复过程中的早期炎症反应、血管生成以及植入物降解的荧光成像实验。这款小动物活体成像系统性能优越，可搭配多款深度制冷的InGaAs近红外相机，高透的成像镜头结合三维平移台，可以实现大视野及局部小动物高信噪比成像（2 cm×2 cm-20 cm×20 cm），配备全自动操作平台，可实现电动对焦，多通道小动物麻醉系统，满足多只小鼠同时成像，激发光源可选配多重波长激光器、X射线、近红外LED等等。自主开发的控制及图像处理软件可以极大的方便用户，使操作变得更简单、图像处理变的更全面。