本文开发了一种微流控体外细胞封装平台，用于研究 3D 微环境参数对细胞命运的影响。该平台基于酶交联的聚乙二醇（PEG）基微凝胶，其机械特性（弹性 300-3000 Pa）、生化特性（如整合素结合肽 RGD）和降解性（含 MMP 底物或非降解肽）可精确调控，成功封装了成纤维细胞、胚胎干细胞（ESCs）、癌细胞等多种细胞。通过优化（如添加 OptiPrep 调节密度、延长胰蛋白酶处理时间），细胞封装效率从 20% 提升至60%；为解决细胞逃逸问题，采用双重封装策略（微凝胶包埋于非降解凝胶中），实现了长达15 天的长期培养，可观察细胞活力、增殖和形态变化。该平台为研究细胞与微环境的相互作用提供了精准工具。
 
1. 引言

• 背景：3D 细胞培养比 2D 更接近原生微环境，但现有技术难以整合微环境多参数（如 ECM 刚度、可溶性信号）的独立调控。
• 研究目标：构建基于微凝胶的 3D 细胞培养平台，实现微环境参数的精准调控，研究细胞对复杂微环境的响应。

  CERO 3D细胞(类器官)生物反应器
2. 结果与讨论
2.1 微流控细胞封装

• 材料设计：采用 8 臂 PEG - 乙烯砜（VS），通过凝血因子 XIIIa（FXIIIa）酶促交联；含 MMP 底物肽（GPQGIWGQ）的微凝胶可降解，含 GDQGIAGF 的为非降解型；RGD 肽促进细胞粘附。
• 微流控装置：四入口流动聚焦设计，中间通道通入 PEG + 细胞混合液，侧通道通入 FXIIIa + 钙缓冲液及含表面活性剂的矿物油，形成单分散微凝胶（直径 80-150 μm）。
• 封装特性：细胞分布符合泊松分布，通过调节初始浓度控制每滴细胞数（0-2 个）；封装后细胞活力达 90%（PI 染色）。

2.2 封装效率优化
问题：细胞与培养基密度差异（1.1 vs 1.0 g/mL）导致沉降，1 小时后封装效率仅 20%。

优化措施：
l 添加 OptiPrep 调节密度：16% OptiPrep（100 μL 培养基中加 16 μL）在 0、30 分钟时细胞数最多，适配成纤维细胞；癌细胞（MDA-MB-231）和 ESCs 需 20% OptiPrep。
l 延长胰蛋白酶处理：8 分钟处理减少细胞聚集，结合 OptiPrep 使效率提升至 60%。
 

OptiPrep 浓度（μL/100μL 培养基）	0 分钟细胞数	30 分钟细胞数	60 分钟细胞数
0	低	显著下降	极低
8	中	下降明显	低
16	高	较高	中
24	中	中	较高
32	低	下降	低

2.3 防止细胞逃逸

• 现象：ESCs 在 20 小时后开始逃逸，癌细胞也存在类似问题，与微凝胶特性和细胞类型相关。
• 解决方案：
  • 方法 1：将微凝胶包埋于 200 μm 厚的非降解 PEG 凝胶（通过 Michael 加成交联），阻止细胞迁移；但不利于细胞回收。
  • 方法 2：微流控双重封装（微凝胶再包埋于非降解 PEG 微珠中），结合 16% OptiPrep 使共封装效率达 40%，实现无细胞逃逸。

2.4 长期培养结果

• 细胞活力：在 5% PEG（40 kPa）外层凝胶中，500 Pa 和 1000 Pa 微凝胶内细胞 15 天存活率较高；10% PEG（100 kPa）外层凝胶因肿胀压迫，细胞活力显著下降。
• 细胞增殖：ESCs 在 500 Pa 微凝胶中 4 天内体积增加 3 倍，1000 Pa 微凝胶中增加 2.5 倍且 4 天时有更多细胞死亡。

3. 结论
该平台实现了微环境多参数的独立调控，通过优化封装效率和解决细胞逃逸，可用于长期研究细胞行为。未来可设计可选择性降解的外层凝胶，以兼顾细胞限制与回收需求。

4. 实验要点

• 材料：PEG 衍生物（8 臂 PEG-VS、4 臂 PEG-SH）、FXIIIa 酶、RGD 肽、OptiPrep 等。
• 微流控芯片：PDMS 材质，通道深度 100-150 μm，流动聚焦设计。
• 表征：流变学测弹性模量，共聚焦显微镜观察细胞形态，活死染色评估活力。

关键问题 该微流控细胞封装平台的核心优势是什么？
核心优势在于微环境参数的精准且独立调控，包括：机械特性（通过 PEG 浓度调节弹性 300-3000 Pa）、生化信号（如 RGD 肽介导细胞粘附）、降解性（含 MMP 底物或非降解肽）；同时结合微流控技术实现单分散微凝胶的高效制备，封装效率可达 60%，并能通过双重封装实现 15 天长期培养。
 
研究中如何解决细胞从微凝胶中逃逸的问题？效果如何？
采用双重封装策略：将细胞负载微凝胶进一步包埋于非降解 PEG 凝胶中（薄膜或微珠形式）。非降解凝胶通过小孔径和高刚度阻止细胞迁移（包括阿米巴运动和间质运动）。结果显示，该方法可完全阻止细胞逃逸，使细胞在 15 天培养中保持在微凝胶内，且能稳定监测活力、增殖和形态。
 
该研究对细胞生物学或再生医学有何潜在应用？
潜在应用包括：系统研究微环境参数（如刚度、生化信号）对细胞命运（如干细胞分化、癌细胞侵袭）的影响；开发高通量药物筛选模型（基于可控微环境）；优化细胞移植策略（通过微凝胶保护细胞免受免疫攻击并调控其功能）。此外，平台的参数可调性为 mechanotransduction（机械传导）机制研究提供了工具。

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