原代肝细胞分离提取的实验方法、流程与结果_abio生物试剂品牌网
Keywords：原代肝细胞；Primary Hepatocytes; 肝细胞分离；肝细胞提取; Hepatocyte Isolation Protocol；Isolation of Primary Hepatocytes
肝脏作为药物暴露的主要器官，在药物的代谢和毒性过程中起着至关重要的作用。原代肝细胞（Primary Hepatocytes）具有完整的细胞特性和生理水平的酶和辅助因子，既包括膜结合酶【如细胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】，也包括胞质酯酶，拥有肝脏中所有的代谢途径。因此，原代肝细胞（Primary Hepatocytes）被广泛认为是构建体外肝脏模型的金标准，在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中受到研究者的青睐。
一、原代肝细胞分离方法
肝细胞分离（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝细胞提取提取有直接剪切法、组织块培养法、胰蛋白酶消化法、两步胶原酶灌注法（Seglen灌注法）、半原位胶原酶灌注法等。
【直接剪切法】
原理：将肝脏切成小块，然后用胶原酶或胰蛋白酶进行消化，分离得到肝细胞。
优点：操作简单，适用于大量细胞的分离。
缺点：细胞损伤较大，纯度较低。
【组织块培养法】
原理：将肝脏切成小块，在培养皿中加入含特定生长因子的培养液进行培养，使组织块贴壁生长，然后逐渐分离得到肝细胞。
优点：能够保持细胞的天然状态，适用于长期培养。
缺点：操作较为繁琐，细胞数量较少。
【胰蛋白酶消化法】
原理：用胰蛋白酶或胰酶对肝脏进行消化，分离得到肝细胞。
优点：能够较为彻底地分解细胞间物质，获得较纯的肝细胞。
缺点：胰蛋白酶的价格较贵，成本较高。
【两步胶原酶灌注法（Seglen灌注法）】
原理：用含有胶原酶的溶液通过门静脉灌注到肝脏中，使肝实质细胞与间质分开，然后收集分离得到肝实质细胞。
优点：能够保持细胞的天然状态，适用于长期培养。
缺点：操作较为繁琐，细胞数量较少。
【半原位胶原酶灌注法】
原理：将肝脏放置在特定装置中，通过门静脉灌注胶原酶溶液，使肝脏在生理状态下进行消化，然后收集分离得到肝实质细胞。
优点：能够较为真实地模拟生理状态，获得的细胞形态、活性较好。
缺点：操作较为复杂，成本较高。
其中，两步胶原酶灌流法因其对肝细胞损伤作用较小，肝细胞产率和存活率高，成为了分离原代肝细胞的经典方法。
二、原代肝细胞分离流程
鉴于此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，在两步胶原酶灌注的基础上，开发了原代肝细胞分离试剂盒，有标准的分离流程（Hepatocyte Isolation Protocol），其内整合了包括灌流液、胶原酶、细胞洗涤液、细胞纯化液、试验耗材等在内的所有组分，可适用于大鼠、小鼠等多个种属原代肝细胞的分离。以下为详细实验流程：
1、实验材料
1)动物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠
2)仪器：恒温水浴锅、水平离心机、移液器、生物安全柜
3)试剂：胶原酶、灌流溶液A、灌流溶液B、消化终止液、分离液添加剂、肝细胞纯化液
4)耗材：0.22um过滤器、20ml无菌注射器、10ml无菌注射器、5ml无菌注射器、无菌纱布、无菌剪刀、无菌镊子、无菌烧杯、无菌擦手纸、无菌50mL离心管及巴氏吸管
2、试剂预处理
1)灌流溶液A：实验前37℃水浴预热30分钟。
2)灌流溶液B：实验前每100mL灌流溶液B中加入1支胶原酶，充分溶解后用0.22µm过滤器过滤。过滤后的溶液加入100uL分离液添加剂，然后37℃水浴预热30分钟。
3)消化终止液：实验前在无菌条件下，每100mL消化终止液中加入100uL分离液添加剂，混匀后置于冰上备用。
3、实验步骤及结果
(一) 肝脏获取
1)尽可能于半分钟内将大鼠断颈处死后用75%酒精喷洒进行全身消毒，并转移至生物安全柜中。
2)用镊子将大鼠下腹部皮肤提起，并使用剪刀从下往上将大鼠腹部表皮剪开，以裸露腹部肌肉部位。
3)更换剪刀将大鼠肌肉部位剪开，使肝脏充分暴露，注意不要将大鼠内脏器官剪破。
(二) 组织处理
1)用剪刀剪开图A所示位置，剪至能清晰可见每叶肝脏上都有较为明显的静脉孔，使用20mL注射器从静脉孔处灌注灌流液A，将每叶肝脏都灌注至土黄色。
2)使用10mL注射器从静脉孔处灌注灌流液B，直至肝脏软烂。
(三) 细胞获取
1)用镊子将肝脏摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL离心管中并用剪刀将其充分剪碎至泥状，补加灌流溶液B至30mL.
2)37℃水浴消化约3min,期间用巴氏吸管不断搅拌。
3)消化结束后按照混悬液与消化终止液1：1的比例加入消化终止液。
4)无菌纱布过滤即得肝细胞悬液。
(四) 细胞洗涤
1)将肝细胞悬液轻轻颠倒混匀，分装至50mL离心管。
2)70g（升速 3、降速 3）、4℃离心 5min。
3)在超净工作台中弃上清，消化终止液重悬细胞沉淀。
(五) 细胞纯化
1)按照 7：3 的比例（即细胞悬液：肝细胞纯化液）加入肝细胞纯化液并混匀。
2)100g（升速 3、降速 3）、4℃离心 10min。
3)弃上清，使用冻存液将细胞重悬，并于液氮罐中保存。
如图所示，该图为IPHASE技术人员此次共分离得到的SD大鼠新鲜肝细胞照片，经0.4%台盼蓝染色后发现细胞活率在90%以上，且数量共有80million，说明以IPHASE原代肝细胞分离试剂盒为提取材料，可获得纯度高、活率好且数量多的新鲜原代肝细胞！
三、IPHASE相关产品
IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，深刻识到原代肝细胞（Primary Hepatocytes）是构建体外肝脏模型的金标准，在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中受到研究者的广泛青睐。因此，在两步胶原酶灌注法的基础上研发了原代肝细胞分离试剂盒，在标准的肝细胞分离流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下进行肝细胞分离（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝细胞提取，并以SD大鼠为实例，证明该试剂盒、该方法具有实用性！除此以外，IPHASE以相似分离流程，研发、生产了多种属、多规格及多性别的悬浮或贴壁原代肝细胞，供客户购买使用，为客户缩短时间，节约成本！
IPHASE生产产品均具有以下优势：
合规性：生产产品的组织均由正规渠道获得，来源清晰。
安全性：生产组织均经过病原检测，保证产品质量安全。
高质量：生产产品均经过严格的内部质控，且同批次数量多，批次间差异性小。
可定制：可根据客户特殊需求，提供特殊种属肝细胞的定制服务。
关 于 我 们
汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。
肝脏作为药物暴露的主要器官，在药物的代谢和毒性过程中起着至关重要的作用。原代肝细胞（Primary Hepatocytes）具有完整的细胞特性和生理水平的酶和辅助因子，既包括膜结合酶【如细胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】，也包括胞质酯酶，拥有肝脏中所有的代谢途径。因此，原代肝细胞（Primary Hepatocytes）被广泛认为是构建体外肝脏模型的金标准，在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中受到研究者的青睐。
一、原代肝细胞分离方法
肝细胞分离（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝细胞提取提取有直接剪切法、组织块培养法、胰蛋白酶消化法、两步胶原酶灌注法（Seglen灌注法）、半原位胶原酶灌注法等。
【直接剪切法】
原理：将肝脏切成小块，然后用胶原酶或胰蛋白酶进行消化，分离得到肝细胞。
优点：操作简单，适用于大量细胞的分离。
缺点：细胞损伤较大，纯度较低。
【组织块培养法】
原理：将肝脏切成小块，在培养皿中加入含特定生长因子的培养液进行培养，使组织块贴壁生长，然后逐渐分离得到肝细胞。
优点：能够保持细胞的天然状态，适用于长期培养。
缺点：操作较为繁琐，细胞数量较少。
【胰蛋白酶消化法】
原理：用胰蛋白酶或胰酶对肝脏进行消化，分离得到肝细胞。
优点：能够较为彻底地分解细胞间物质，获得较纯的肝细胞。
缺点：胰蛋白酶的价格较贵，成本较高。
【两步胶原酶灌注法（Seglen灌注法）】
原理：用含有胶原酶的溶液通过门静脉灌注到肝脏中，使肝实质细胞与间质分开，然后收集分离得到肝实质细胞。
优点：能够保持细胞的天然状态，适用于长期培养。
缺点：操作较为繁琐，细胞数量较少。
【半原位胶原酶灌注法】
原理：将肝脏放置在特定装置中，通过门静脉灌注胶原酶溶液，使肝脏在生理状态下进行消化，然后收集分离得到肝实质细胞。
优点：能够较为真实地模拟生理状态，获得的细胞形态、活性较好。
缺点：操作较为复杂，成本较高。
其中，两步胶原酶灌流法因其对肝细胞损伤作用较小，肝细胞产率和存活率高，成为了分离原代肝细胞的经典方法。
二、原代肝细胞分离流程
鉴于此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，在两步胶原酶灌注的基础上，开发了原代肝细胞分离试剂盒，有标准的分离流程（Hepatocyte Isolation Protocol），其内整合了包括灌流液、胶原酶、细胞洗涤液、细胞纯化液、试验耗材等在内的所有组分，可适用于大鼠、小鼠等多个种属原代肝细胞的分离。以下为详细实验流程：
1、实验材料
1)动物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠
2)仪器：恒温水浴锅、水平离心机、移液器、生物安全柜
3)试剂：胶原酶、灌流溶液A、灌流溶液B、消化终止液、分离液添加剂、肝细胞纯化液
4)耗材：0.22um过滤器、20ml无菌注射器、10ml无菌注射器、5ml无菌注射器、无菌纱布、无菌剪刀、无菌镊子、无菌烧杯、无菌擦手纸、无菌50mL离心管及巴氏吸管
2、试剂预处理
1)灌流溶液A：实验前37℃水浴预热30分钟。
2)灌流溶液B：实验前每100mL灌流溶液B中加入1支胶原酶，充分溶解后用0.22µm过滤器过滤。过滤后的溶液加入100uL分离液添加剂，然后37℃水浴预热30分钟。
3)消化终止液：实验前在无菌条件下，每100mL消化终止液中加入100uL分离液添加剂，混匀后置于冰上备用。
3、实验步骤及结果
(一) 肝脏获取
1)尽可能于半分钟内将大鼠断颈处死后用75%酒精喷洒进行全身消毒，并转移至生物安全柜中。
2)用镊子将大鼠下腹部皮肤提起，并使用剪刀从下往上将大鼠腹部表皮剪开，以裸露腹部肌肉部位。
3)更换剪刀将大鼠肌肉部位剪开，使肝脏充分暴露，注意不要将大鼠内脏器官剪破。
(二) 组织处理
1)用剪刀剪开图A所示位置，剪至能清晰可见每叶肝脏上都有较为明显的静脉孔，使用20mL注射器从静脉孔处灌注灌流液A，将每叶肝脏都灌注至土黄色。
2)使用10mL注射器从静脉孔处灌注灌流液B，直至肝脏软烂。
(三) 细胞获取
1)用镊子将肝脏摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL离心管中并用剪刀将其充分剪碎至泥状，补加灌流溶液B至30mL.
2)37℃水浴消化约3min,期间用巴氏吸管不断搅拌。
3)消化结束后按照混悬液与消化终止液1：1的比例加入消化终止液。
4)无菌纱布过滤即得肝细胞悬液。
(四) 细胞洗涤
1)将肝细胞悬液轻轻颠倒混匀，分装至50mL离心管。
2)70g（升速 3、降速 3）、4℃离心 5min。
3)在超净工作台中弃上清，消化终止液重悬细胞沉淀。
(五) 细胞纯化
1)按照 7：3 的比例（即细胞悬液：肝细胞纯化液）加入肝细胞纯化液并混匀。
2)100g（升速 3、降速 3）、4℃离心 10min。
3)弃上清，使用冻存液将细胞重悬，并于液氮罐中保存。
如图所示，该图为IPHASE技术人员此次共分离得到的SD大鼠新鲜肝细胞照片，经0.4%台盼蓝染色后发现细胞活率在90%以上，且数量共有80million，说明以IPHASE原代肝细胞分离试剂盒为提取材料，可获得纯度高、活率好且数量多的新鲜原代肝细胞！
三、IPHASE相关产品
IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，深刻识到原代肝细胞（Primary Hepatocytes）是构建体外肝脏模型的金标准，在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中受到研究者的广泛青睐。因此，在两步胶原酶灌注法的基础上研发了原代肝细胞分离试剂盒，在标准的肝细胞分离流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下进行肝细胞分离（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝细胞提取，并以SD大鼠为实例，证明该试剂盒、该方法具有实用性！除此以外，IPHASE以相似分离流程，研发、生产了多种属、多规格及多性别的悬浮或贴壁原代肝细胞，供客户购买使用，为客户缩短时间，节约成本！
| 产品 | 种属 | 规格 |
| 原代肝细胞分离试剂盒 | 多种属 | 1套 |
| 新鲜/冻存悬浮肝细胞 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠/猫/猪/兔/鸡/金黄地鼠 | 2/5 miliion |
| 新鲜/冻存贴壁肝细胞 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠/猫/猪/兔 | 2/5 miliion |
| 培养基 | 复苏/铺板/维持/代谢 | 10/20/50 mL |
| 胶原包被板 | 6/12/24/48/96孔 | 1/5块 |
| 超低吸附培养板平底 | 6/12/24/48/96孔 | 1/5 个 |
| 超低吸附培养板U底 | 96孔 | 1/5 个 |
IPHASE生产产品均具有以下优势：
合规性：生产产品的组织均由正规渠道获得，来源清晰。
安全性：生产组织均经过病原检测，保证产品质量安全。
高质量：生产产品均经过严格的内部质控，且同批次数量多，批次间差异性小。
可定制：可根据客户特殊需求，提供特殊种属肝细胞的定制服务。
关 于 我 们
汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。
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