方案摘要：本方案聚焦 PIpetty 电动移液器在动物布鲁氏菌病微量法补体结合试验中的应用。通过其高精度移液功能，精准控制抗原、血清、补体等试剂用量，减少人为误差，降低假阴 / 阳性率，提升检测准确性。同时，利用连续分液模式，加速 96 孔板批量加样，效率有效提升，适配基层兽医站、海关等大量样品检测场景，为布鲁氏菌病防控提供高效可靠的技术支持。
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方案详情：
一、实验原理
布鲁氏菌病微量法补体结合试验基于抗原 - 抗体特异性结合与补体参与的免疫反应原理。试验中，布鲁氏菌抗原与待检血清中的特异性抗体结合，会固定补体；若血清中无对应抗体，补体则与溶血素 - 绵羊红细胞复合物结合，引发溶血。通过观察微量反应体系（如 96 孔板）中是否溶血及溶血程度，判断血清中是否存在布鲁氏菌抗体，从而实现对动物感染情况的检测。该方法利用补体的桥梁作用，将抗原抗体反应转化为可观察的溶血现象，具有特异性强、灵敏度高的特点。
 
二、‌实验准备
1、设配和材料
① 水浴锅（温控范围为 37 ℃~38 ℃和 54 ℃~64 ℃）。
② Pipetty电动移液器MSIC01-03-250和灭菌吸头。
③ 96孔U形聚苯乙烯板。
④ 稀释用器皿。
 
2、试剂和材料
① 稀释液：巴比妥缓冲液（1X）或不含巴比妥缓冲液。
② 绵羊红细胞悬液，除使用商品化绵羊红细胞外。
③ 布鲁氏菌阳性对照血清和阴性对照血清。
④ 溶血素，在有效期内根据说明书标示效价使用。
⑤ 补体，每次补体结合试验时，应于当日测定补体效价。优先使用商品化冻干补体，也可使用新鲜豚鼠血清作为补体。
⑥ 抗原，在有效期内根据说明书标示效价进行使用。
⑦ 溶血标准比色管。
 
三、实验步骤
1、每次试验应设阳性血清、阴性血清、抗原、致敏红细胞和补体对照。补体结合试验各要素添加量和顺序见表5，具体操作按以下试验程序：
a） 血清样品稀释，96 孔板第 1、2排作为血清抗补体对照，血清稀释度为 1/2、1/4;从第3排到第8排血清样品稀释度分别为 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，按如下步骤操作：
1）使用Pipetty电动移液器，设置连续分液功能，在第1排每孔分别加 50μL稀释液，第 2、4、5、6、7、8排每孔分别加稀释液 25 μL，丢弃吸头;
2）在第1排每孔加 50 μL灭能血清，设置混匀模式，自动混匀后吸取 25μL，加入其后的第2排孔，混匀后弃去 25 μL;
3）从第1排孔混匀液体中先后各吸取 25μL，分别加入同列的第3排、第4排孔，混匀;
4）从第4排起倍比稀释，即从第4排孔吸取液体 25 μL，到同列第5排孔，混匀，以此类推到第8排;
5）第8排孔吸取 25 μL 液体弃去。
b）加抗原，除第1排、第2排外，上述每孔分别加工作量抗原 25 μL。
c）加补体，上述每孔分别加工作浓度补体 25 μL，轻轻混匀，置 4 ℃孵育过夜或 37 ℃孵育 30 min。
d）制备致敏红细胞，将 2.5%红细胞及溶血素等体积混匀至室温 20 min。
e）孵育，将孵育过夜的 96 孔板从冰箱取出置 37 ℃孵育 10 min。
f）加致敏红细胞，上述每孔加入 50 μL致敏红细胞，轻轻混匀，37 ℃孵育 30 min。
g）在室温条件下1000g离心5min~10 min，或者在 2℃~8 ℃放置 2h~3h让细胞自然沉降，观察判定。
   
四、结果判定
1、满足下列条件，试验成立：
阳性血清的抗补体对照、阴性血清对照、阴性血清抗补体对照、抗原对照和补体对照呈完全溶血反应，致敏红细胞对照是完全抑制溶血反应。
2、满足试验成立条件，将待检血清孔与溶血标准比色孔进行比色，记录结果，并按表6，将溶血抑制的百分比换算成标准的国际单位。结果判定标准：待检血清的溶血抑制程度>20 IU/mL判为抗体阳性。