非洲猪瘟P54抗体制备方法及核心参数_abio生物试剂品牌网
非洲猪瘟（African Swine Fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的猪烈性传染病，P54 蛋白是 ASFV 的重要结构蛋白（由病毒 B646L 基因编码），具有高度保守性和免疫原性，是诊断试剂研发的关键靶标。针对 P54 蛋白的单克隆抗体（P54 mAb）因特异性强、稳定性高，被广泛用于 ASF 的快速检测与诊断。以下从制备方法及核心参数（特异性、交叉率、检出限、灵敏度等）展开说明：
一、非洲猪瘟 P54 单克隆抗体的制备流程 P54 单克隆抗体的制备基于杂交瘤技术，核心步骤包括抗原制备、免疫小鼠、细胞融合及抗体筛选，具体流程如下：
二、P54 单克隆抗体的核心参数及意义
1. 特异性（Specificity）
三、参数优化与应用场景 P54 单克隆抗体的参数需根据应用场景调整：
一、非洲猪瘟 P54 单克隆抗体的制备流程 P54 单克隆抗体的制备基于杂交瘤技术，核心步骤包括抗原制备、免疫小鼠、细胞融合及抗体筛选，具体流程如下：
- 抗原制备
- 以 ASFV P54 蛋白为抗原：可通过原核表达（如大肠杆菌表达重组 P54 蛋白）或真核表达（如昆虫细胞表达带修饰的 P54 蛋白，更接近天然构象）获得高纯度抗原，纯度需达 90% 以上，避免杂蛋白干扰免疫效果。
- 小鼠免疫
- 选择 6-8 周龄 BALB/c 小鼠，采用 “基础免疫 + 加强免疫” 方案：首次免疫用弗氏完全佐剂乳化抗原（剂量 50-100μg / 只），皮下或腹腔注射；2-3 周后用弗氏不完全佐剂加强免疫 2-3 次，最后一次免疫后 3-5 天取血清检测抗体效价（效价≥1:10000 可进行下一步）。
- 细胞融合与筛选
- 取免疫小鼠的脾脏 B 淋巴细胞，与骨髓瘤细胞（如 SP2/0）在 PEG（聚乙二醇）作用下融合，形成杂交瘤细胞；
- 通过 HAT 培养基筛选杂交瘤细胞（排除未融合的 B 细胞和骨髓瘤细胞），再用间接 ELISA 法筛选能分泌抗 P54 抗体的阳性克隆。
- 克隆化与抗体生产
- 对阳性杂交瘤细胞采用有限稀释法或流式细胞术克隆化，确保单克隆性；
- 克隆稳定后，可通过小鼠腹腔接种生产腹水型抗体，或通过无血清培养基体外培养生产培养液型抗体，经 Protein G/A 亲和层析纯化，纯度可达 95% 以上。
二、P54 单克隆抗体的核心参数及意义
1. 特异性（Specificity）
- 定义：指抗体仅与 ASFV P54 蛋白结合，而不与其他无关蛋白或病原体蛋白交叉反应的能力。
- 检测方法：
- 采用 Western blot 检测抗体与重组 P54 蛋白的结合（应出现单一特异性条带，分子量约 54 kDa）；
- 检测与其他猪病毒（如猪瘟病毒 CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒 PRRSV、伪狂犬病病毒 PRV）的结构蛋白是否交叉反应；
- 检测与健康猪组织蛋白（如肝、脾、肾匀浆）的交叉反应。
- 理想标准：仅特异性识别 ASFV P54 蛋白，与其他病毒及猪自身蛋白无交叉反应，确保诊断特异性。
- 定义：指抗体与非目标抗原（如其他 ASFV 毒株的 P54 蛋白、近缘病毒蛋白）发生交叉反应的概率，通常以百分比表示。
- 检测对象：
- 不同 ASFV 基因型毒株（全球已发现 24 种基因型）的 P54 蛋白（因 P54 高度保守，交叉率应接近 100%，确保对各毒株均有反应）；
- 其他非洲猪瘟相关病毒（如无，因 ASFV 为唯一成员）或干扰病毒（如上述 CSFV、PRV 等，交叉率应≤1%）。
- 关键意义：对 ASFV 不同毒株的高交叉率可保证检测覆盖范围，对其他病毒的低交叉率可避免假阳性。
- 定义：指抗体可检测到的 P54 蛋白最低浓度（或 ASFV 病毒最低滴度），是衡量检测灵敏度的核心指标。
- 检测方法：
- 用梯度稀释的重组 P54 蛋白（如 100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL…）通过 ELISA 检测，以信号值为阈值 2.1 倍时的浓度为 LOD；
- 用梯度稀释的 ASFV 病毒液（如 10⁶ TCID₅₀/mL、10⁵ TCID₅₀/mL…）通过免疫荧光或胶体金法检测，确定可识别的最低病毒滴度。
- 典型范围：优质 P54 单克隆抗体的 ELISA 检出限通常可达0.1-1 ng/mL（重组蛋白）或10²-10³ TCID₅₀/mL（病毒液），满足早期感染检测需求。
- 定义：指抗体在低浓度抗原存在时仍能产生可识别信号的能力，与检出限直接相关（检出限越低，灵敏度越高）。
- 实际应用意义：在 ASF 早期感染（病毒载量低）或亚临床感染阶段，高灵敏度抗体可避免漏检。例如，发病前 2-3 天的猪血液中病毒含量较低，高灵敏度抗体可通过 ELISA 或胶体金试纸条检出，为疫情防控争取时间。
- 评价方式：通过系列稀释的阳性样本（病毒液或 P54 蛋白）检测，计算阳性检出率（如 LOD 时的检出率应≥95%）。
- 亲和力（Affinity）：指抗体与 P54 抗原的结合强度，通常以平衡解离常数（Kd）表示，优质抗体 Kd 应≤10⁻⁸ M（数值越小，亲和力越强），可提高检测反应速度和稳定性。
- 效价（Titer）：指抗体能与抗原发生可检测反应的最高稀释倍数（如腹水抗体效价通常≥1:10⁵，培养液抗体效价≥1:10⁴），反映抗体浓度和活性。
- 稳定性：包括热稳定性（37℃放置 7 天或 4℃放置 6 个月，效价下降≤20%）和批次间一致性（不同批次抗体的检出限、特异性差异≤10%），确保产业化应用的可靠性。
三、参数优化与应用场景 P54 单克隆抗体的参数需根据应用场景调整：
- 胶体金试纸条：需高灵敏度（LOD≤10³ TCID₅₀/mL）、快速反应（亲和力高），适合现场快速筛查；
- ELISA 试剂盒：需高特异性（交叉率低）、宽线性范围（1-1000 ng/mL），适合实验室定量检测；
- 病毒分离鉴定：需对各基因型毒株高交叉率，确保不遗漏变异毒株。
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