该研究由Yusaku Hontani、Fei Xia和Chris Xu等人合作完成，发表于《Science Advances》，题为《Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brAIn》。研究团队来自康奈尔大学应用与工程物理系及生物医学工程系，长期致力于多光子显微镜技术的创新与应用。

重要发现
01传统多光子成像的技术瓶颈与突破方向
多光子荧光显微镜通过长波长光子的非线性激发实现深层成像，其中双光子显微镜（2PM）和三光子显微镜（3PM）是主流技术。与2PM相比，3PM凭借更长的激发波长（如1300nm和1700nm）和更高的非线性限制，在深层组织（如小鼠脑海马区）中具有更强的穿透能力和图像对比度。

然而，传统3PM的多色成像面临核心挑战：不同颜色荧光分子（如绿色和红色）的激发光谱差异大，需依赖双波长（如1300nm和1700nm）分别激发，导致光学系统复杂、总激发功率高，且信号强度因三阶非线性效应较弱而受限。

这一蓝移激发机制带来两大突破：
（1）单波长兼容多色荧光：使用1340nm单一波长，即可同时激发绿色荧光分子（如GCaMP6s）至最低激发态（对应1300nm光学窗口的传统路径），以及红色荧光分子至更高激发态，实现绿色（525nm发射）、红色（617nm发射）荧光的同步采集。

（2）信号强度显著增强：在1300nm波段，部分红色荧光分子（如Texas Red、SR 101）的三光子激发截面比传统1700nm波段提升10倍以上。例如，Texas Red 在1340nm处的三光子截面达～11×10⁻⁸²cm⁶(s/photons)²，而1700nm处仅为～0.56×10⁻⁸²cm⁶(s/photons)²，信号强度提升约20倍。

PrismPlus转基因小鼠在1340nm激发下荧光蛋白的多色3P荧光图像

多色成像能力
利用1340nm单波长，成功同时成像GCaMP6s标记的神经元（绿色）、Texas Red标记的血管（红色）及三次谐波生成（THG，蓝色），深度达1200μm；在PrismPlus转基因小鼠中，进一步实现Cerulean（青色）、EGFP（绿色）、YFP（黄色）、DsRed-Max（红色）四色荧光的同步采集，验证了技术的普适性。

光稳定性提升
对比SR101在1340nm和1700nm激发下的光漂白速率，前者的荧光衰减速度降低约50%，表明蓝移激发可减少长期成像中的光损伤。

体内小鼠大脑中Texas Red标记血管的多光子图像

创新与亮点
01突破多色成像的技术壁垒
传统多光子成像中，多色荧光需依赖双波长激光源、复杂光路切换及功率叠加，不仅增加实验成本，还可能因光毒性限制成像时长。本研究通过单波长激发兼容多色荧光分子，无需额外光学组件即可实现绿色、红色甚至四色荧光的同步采集，简化了系统复杂度，为实时动态观测细胞间相互作用提供了可能。

总结与展望
多光子荧光显微镜技术的革新始终围绕“更深、更亮、更精准”的目标。该研究通过蓝移激发机制，将单波长多色成像与深层穿透能力结合，不仅解决了传统3PM的技术瓶颈，更开辟了荧光分子激发的新维度——无需依赖新型荧光蛋白或复杂合成，即可通过现有分子的高阶激发态实现性能跃升。未来该技术有望在以下方向拓展，结合光纤探针或微型化显微镜，实现自由活动动物的脑内动态多色成像，推动神经环路功能研究。与光遗传学、电生理记录等技术结合，构建“结构-功能-调控”一体化的研究平台。基于蓝移激发原理，系统性筛选具有高激发截面的荧光分子，进一步优化成像信噪比。

从实验室到应用，单波长三光子显微镜正以其创新性和实用性，为探索生命奥秘打开一扇更明亮的“光学窗口”。随着技术的普及，我们有望在不久的将来，更清晰地解码大脑神经网络的动态图谱，乃至实时观测肿瘤微环境、器官发育等复杂生物学过程。

DOI:10.1126/sciadv.abf3531.