一、犬轮状病毒（CRV）概述

犬轮状病毒（Canine Rotavirus, CRV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起幼犬腹泻的主要病原之一，尤其对 2-6 周龄幼犬致死率较高。CRV 基因组为分节段双链 RNA，其外层衣壳蛋白 VP4 和 VP7 是主要抗原蛋白，也是中和抗体的关键靶点。制备高特异性抗 CRV 单克隆抗体（mAb），对病毒检测、中和机制研究及抗病毒药物开发具有重要价值。

二、抗 CRV 单克隆抗体制备流程
（一）CRV 抗原制备与优化

1. 病毒培养与纯化

   • 细胞培养：选用 MA-104 细胞（恒河猴肾细胞），用含 1 μg/mL 胰酶的 MEM 培养基培养 CRV（如 A79/10 株），37℃吸附 1 小时后，换无血清培养基继续培养 48-72 小时，收集含病毒的上清液。
   • 纯化工艺： 
     • 超速离心法：上清液经 4℃ 100,000×g 离心 2 小时，沉淀用 Tris-HCl 缓冲液重悬；
     • 蔗糖密度梯度离心（10%-40% 蔗糖）：进一步纯化病毒颗粒，电镜观察确认完整病毒粒子（直径约 70 nm，双层衣壳结构）。

2. 抗原组分筛选

   • VP4/VP7 蛋白表达：克隆 CRV VP4（47 kDa）和 VP7（38 kDa）基因，构建至杆状病毒 - 昆虫细胞表达系统（Sf9 细胞），获得具有天然构象的重组蛋白（含糖基化修饰），通过 Ni 柱亲和层析纯化后，用 ELISA 筛选免疫原性强的组分（优先选择 VP7，因其为中和抗体主要靶点）。

（二）动物免疫与效价检测

1. 免疫方案

   • 对象：6-8 周龄 Balb/c 小鼠（3-5 只），免疫前检测血清背景（确保无 CRV 抗体）。
   • 程序：
     ① 初次免疫：腹腔注射纯化 CRV 病毒（10⁶ TCID₅₀/ 只）或重组 VP7 蛋白（50 μg / 只）+ 弗氏完全佐剂；
     ② 加强免疫：每 2 周一次，共 3 次，使用弗氏不完全佐剂；
     ③ 末次免疫：融合前 3 天，静脉注射无佐剂抗原（病毒或蛋白），刺激脾细胞活化。

2. 效价监测

   • 末次免疫后 7 天，采集小鼠血清，以 CRV 病毒或 VP7 蛋白包被 ELISA 板（1 μg/mL），检测抗体效价，选择效价≥1:50,000 且能中和 CRV 感染的小鼠（中和试验效价≥1:100）进行脾细胞提取。

（三）杂交瘤细胞构建与筛选

1. 细胞融合

   • 取免疫小鼠脾脏制备单细胞悬液（1×10⁸个），与 SP2/0 骨髓瘤细胞按 5:1 比例混合，用 50% PEG 1500 诱导融合，接种于 HAT 培养基，7 天后换 HT 培养基筛选。

2. 克隆筛选与鉴定

   • 初筛（间接 ELISA）：以 CRV 病毒包被 96 孔板，筛选上清 OD 值≥阴性对照 2.1 倍的孔；
   • 复筛（中和试验）：对初筛阳性孔培养上清进行病毒中和试验（在 MA-104 细胞中测定抑制 50% CPE 的抗体稀释度，中和效价≥1:200）；
   • 表位鉴定：采用 ELISA 竞争法，筛选识别不同 VP7 表位的抗体（如线性表位 vs 构象表位），优先保留构象表位抗体（中和活性更强）；
   • 克隆化：有限稀释法进行 3 次单克隆化，获得稳定分泌中和抗体的细胞株。

（四）抗体生产与纯化

1. 腹水制备

   • 给 Balb/c 小鼠腹腔注射石蜡油预处理，7 天后接种杂交瘤细胞（1×10⁶个 / 只），7-10 天后收集腹水，4℃离心（3000 rpm，10 min），上清经 0.22 μm 滤膜过滤。

2. 纯化工艺

   • Protein G 亲和层析：腹水通过 Protein G 柱纯化 IgG 类抗体，洗脱液用 PBS 透析，超滤浓缩至 1-2 mg/mL；
   • 纯度验证：SDS-PAGE 检测显示单一 IgG 条带，纯度≥95%，Western blot 验证其与 CRV VP7 蛋白的特异性结合。

（五）抗体功能鉴定

1. 中和活性测定

   • 空斑减少试验（PRNT）：测定抗体抑制 CRV 在 MA-104 细胞中形成空斑的能力，计算中和效价（IC₅₀），高活性抗体 IC₅₀≤1 μg/mL；
   • 病毒吸附抑制试验：检测抗体是否阻断 CRV 与细胞受体（如整合素 α₂β₁）的结合，验证中和机制。

2. 特异性与交叉反应

   • 种属特异性：ELISA 检测抗体与猫轮状病毒（FRV）、猪轮状病毒（PRV）的交叉反应，要求交叉反应率＜5%；
   • 病毒株覆盖性：测试抗体对 CRV 不同亚型（如 G3、G5 型）的中和活性，筛选广谱中和抗体。

三、关键技术难点与解决方案 难点 解决方案 CRV 培养滴度低 优化培养条件：添加胰酶（激活 VP4 蛋白切割，增强感染性），使用低血清培养基（减少蛋白干扰） 中和表位筛选困难 构建 VP7 蛋白突变体库，通过点突变定位中和表位，优先选择保守区域（如 G-H 环）抗体 抗体依赖性增强（ADE）风险 筛选时排除与 Fc 受体结合的抗体（如通过 FcγR 结合试验），避免 ADE 效应（尤其用于治疗时） 四、应用场景

1. 临床诊断

   • 胶体金层析试纸条：制备双抗体夹心试纸条，检测幼犬粪便中的 CRV 抗原，15 分钟内出结果，灵敏度达 10⁴ TCID₅₀/mL，符合 OIE 诊断标准；
   • RT-PCR 辅助检测：抗体中和预处理样本，区分活病毒与灭活病毒，提高核酸检测的临床意义。

2. 中和机制研究

   • 病毒 - 抗体共晶解析：通过 X 射线晶体学分析抗体与 VP7 的结合位点，指导广谱中和抗体设计；
   • 病毒变异监测：用抗体检测 CRV 流行株的抗原漂移，辅助疫苗株更新（如 VP7 基因序列与抗体中和效价关联分析）。

3. 治疗与预防

   • 单克隆抗体疗法：高中和活性抗体腹腔注射用于幼犬 CRV 感染治疗，降低腹泻发生率（动物实验显示保护率≥80%）；
   • 抗体 - 药物偶联物：将抗体与 RNA 聚合酶抑制剂偶联，靶向递送药物至感染细胞，抑制病毒复制（临床前研究阶段）。

五、注意事项

1. 病毒培养安全：CRV 虽对人无致病性，但操作需在 BSL-2 实验室进行，避免交叉污染；
2. 抗体亚型选择：治疗用抗体优先选择 IgG2a 亚型（小鼠来源），减少 FcγR 结合引发的 ADE 风险；
3. 批次稳定性：腹水抗体需统一纯化工艺，冻融 3 次后效价下降应≤15%；
4. 诊断试剂标准化：建立 CRV 抗体标准品（如 WHO 参考血清），确保不同试剂盒结果可比。

抗 CRV 单克隆抗体的制备核心在于以 VP7 蛋白为靶点，结合中和试验筛选高活性抗体，并通过表位分析提升其广谱性。该类抗体不仅可用于 CRV 感染的快速诊断，还为幼犬轮状病毒病的治疗提供了新的生物制剂方向，具有重要的兽医临床价值。