引言｜面对双特异性抗体的复杂结构如何“应对分离挑战”？

双特异性抗体（BsAbs）以其多靶点机制在肿瘤免疫治疗中展现巨大潜力。截至2024年底，已有19款BsAb药物上市，300多项临床试验在全球范围内开展。

由于双特异性抗体的巨大治疗潜力促使迄今为止已开发出超过50种不同的重组双特异性抗体结构。其可大致分为两类：不含Fc区的（Non IgG like BsAb）和含Fc区域（IgG like BsAb），含Fc区域又分为对称性(Symmetric)和非对称性双抗（Asymmetric）。

但BsAbs独特的结构复杂性，也带来了大量产品相关杂质，如同源二聚体（homodimer）、轻链缺失产物（LC-missing byproduct）、半抗（half antibody）以及聚集体等。由于这些杂质与目标分子的物理化学性质接近，常规的离子交换层析往往难以实现有效分离。

为此，复合模式层析（Mixed-Mode Chromatography）作为一种集多种作用力于一体的新型分离纯化介质，正在双抗纯化中发挥关键作用。

什么是复合模式层析？

博格隆研发的Diamond MMC Mustang为代表的复合模式介质，具有以下多重机制：

•弱阳离子交换作用

•氢键作用

•疏水作用

可广泛适用于聚集体、片段、轻链缺失产物、半抗、同源二聚体等复杂杂质的去除。

工艺实证案例 去除聚集体与片段

•分子：Bispecific antibody

•样品：Protein A eluate (pH adjusted to 5.5)

•Buffer：50 mM NaAc-HAc, pH 5.5；50 mM NaAc-HAc, 1 M NaCl, pH 5.5

•上样载量：35 g/L 与 80 g/L

•梯度：0-100% B 20CV线性盐浓度递增

结果：Diamond MMC Mustang在不同载量下分辨率稳定，媲美进口对标产品

Fig.1 Diamond MMC Mustang与某进口介质分离纯化层析图谱

Fig.2 Diamond MMC Mustang与某进口介质分离后样品的SDS-PAGE结果

去除轻链缺失产物

•分子：Symmetric WuXiBody

•分离原理：PI差异（双抗与LC-missing byproduct相差0.21）→结合力不同 → 成功分离

•样品：Protein A eluate (pH adjusted to 6.0)

•Buffer：40 mM phosphate buffer, pH 6.0；40 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 6.0

•梯度：0-100% B 20CV线性盐浓度递增

结果：实现双抗与LC-missing byproduct的分离，由SDS-PAGE图可峰尾为LC-missing byproduct。

Fig.3 复合阳离子介质分离LC-missing byproduct层析图谱以及质控

线性pH梯度去除半抗与homodimer

•分子：Bispecific antibody(Asymmetric IgG-like knobs-into-holes)

•分离原理：半抗、hole-hole homodimer、bsAb、聚集体在复合性阳离子上的结合力差异

•样品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)

•Buffer：20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mMTris, 20mM glycine, pH 5.5；20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mM Tris, 20mM glycine, pH10.0

•梯度：0-100% B 20CV线性pH递增

结果：由层析图谱和SDS-PAGE图可知成功分离半抗、homodimer与聚集体

Fig.4 复合阳离子介质分离半抗、homodimer层析图谱以及质控

利用疏水作用去除片段与聚集体

•分子：Bispecific antibody

•分离原理：高盐结合，低盐洗脱 → 去除片段与聚集体

•样品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)

•Buffer：50 mM Tris-HAc, 1 M (NH4)2SO4, pH 7.0；50 mM Tris-HAc, pH 7.0

•上样载量：30 g/L

•梯度：0-100% B 20CV 盐浓度递减（1M (NH₄)₂SO₄ → 0）

结果：成功分离片段与聚集体，与进口对标产品表现一致

Fig.5 复合阳离子介质分离片段、聚集体层析图谱以及质控

Diamond MMC Mustang批次间一致性评估

为了评估填料的批次间的一致性，本实验使用三个不同批次的Diamond MMC Mustang介质分别装填的色谱柱，在相同条件下进行了三次纯化。

•由叠加层析图谱，可知三批次洗脱图谱重现性高，分离效果优异，,三个批次性能高度一致，如下图所示

•三批次5%DBC也表现出一致性（批次1、2和3的5%DBC分别为94、94和95 mg/ml）

•三批次洗脱液质量、收率表现一致

Fig.6  Diamond MMC Mustang介质三个批次的层析图谱

小结

复合模式层析作为双抗下游纯化的重要补充手段，凭借其多种作用机制，能有效解决常规层析难以分离的杂质问题。它不仅为产品质量提升提供保障，也为工艺流程简化提供了新思路。

想了解更多复合层析工艺优化？欢迎联系我们获取资料与技术支持！

 

参考文献

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[5] Zhang, Shengwei , et al. "Evaluating a new mixed-mode resin Diamond MMC Mustang using Capto MMC ImpRes as a benchmark." Protein Expression and Purification 186(2021):105930.

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