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抗猪瘟病毒（CSFV）单克隆抗体的制备及应用场景_abio生物试剂品牌网

abiopp3个月前 (06-19)技术9

一、基本概念抗猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus, CSFV）单克隆抗体（Monoclonal Antibody, mAb）是通过杂交瘤技术制备的，能特异性识别 CSFV 表面抗原表位的单一抗体分子，具有高度特异性和均一性，在猪瘟诊断、病毒研究及相关生物制品开发中具有重要应用价值。
二、制备流程
（一）抗原制备

CSFV 毒株选择：常用强毒株（如石门株）或疫苗株（如 C 株），在易感细胞（如猪肾细胞 PK-15、猪睾丸细胞 ST 等）中培养增殖，通过灭活（甲醛或 β- 丙内酯）或纯化处理获得抗原。
抗原纯化：采用蔗糖密度梯度离心、亲和层析等方法纯化病毒粒子，确保抗原纯度，减少非特异性反应。

（二）动物免疫

免疫动物：通常选择 6-8 周龄 Balb/c 小鼠，通过腹腔注射 CSFV 抗原（辅以弗氏完全佐剂 / 不完全佐剂），免疫周期约 4-6 周，末次免疫后 3-5 天取脾脏制备脾细胞。

（三）杂交瘤细胞制备

细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞（如 SP2/0、NS0）按比例（通常 3:1-10:1）混合，使用聚乙二醇（PEG）或电融合法诱导融合。
筛选与克隆：融合细胞接种于 HAT 培养基（含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶）筛选，通过间接 ELISA 法筛选能分泌抗 CSFV 抗体的杂交瘤细胞，再经有限稀释法克隆化，获得单克隆细胞株。

（四）抗体生产与纯化

体内诱生法：将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，收集腹水，通过辛酸 - 硫酸铵沉淀、Protein A/G 亲和层析等方法纯化抗体。
体外培养法：在无血清培养基中大规模培养杂交瘤细胞，离心收集上清液，经纯化获得抗体。

三、关键特性参数
（一）免疫学特性

特异性：能特异性识别 CSFV 的结构蛋白（如 E2 糖蛋白，主要抗原表位所在区域），与其他猪病毒（如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等）无交叉反应。
亲和力：亲和力常数（KD）通常在 10⁻⁸-10⁻¹² M 之间，高亲和力抗体可提高诊断灵敏度。
中和活性：部分单克隆抗体具有中和病毒感染的能力，可用于中和试验（VNT），评估抗体对 CSFV 的抑制效果。

（二）分子生物学特性

抗体类型：小鼠源单克隆抗体多为 IgG1、IgG2a 等亚型，轻链为 κ 或 λ 型，可通过亚型鉴定试剂盒确定。
分子量：完整抗体分子约 150 kDa（重链 50 kDa + 轻链 25 kDa×2），若为单链抗体（scFv）则分子量约 25-30 kDa。

（三）应用相关参数

效价：腹水抗体效价通常可达 1×10⁵-1×10⁶（ELISA 法测定），细胞培养上清效价约 1×10³-1×10⁴。
灵敏度与检测限：在 ELISA 检测中，对 CSFV 的最低检测限可达 ng/mL 级，具体取决于抗体与抗原的结合效率及检测方法优化。
稳定性：纯化抗体在 4℃可保存数月，-20℃冻存可稳定数年，避免反复冻融。

四、主要应用场景

诊断检测：
- 用于 ELISA、免疫荧光（IFA）、胶体金试纸条等方法，检测猪血清、组织液中的 CSFV 抗原或抗体。
- 作为标准品或质控品，校准诊断试剂盒的准确性。
病毒研究：
- 标记 CSFV 蛋白，研究病毒入侵、复制及组装机制。
- 筛选病毒中和表位，辅助疫苗设计（如亚单位疫苗开发）。
生物制品开发：
- 制备双抗体夹心 ELISA 试剂盒，提高猪瘟检测的特异性和灵敏度。
- 与抗病毒药物联用，探索抗体 - 药物偶联物（ADC）在猪瘟治疗中的潜力（实验阶段）。

五、制备难点与优化方向

难点：CSFV 抗原表位易变异，可能导致单克隆抗体对不同毒株的识别能力差异；部分高亲和力抗体可能因表位遮挡，中和活性有限。
优化方向：
- 采用多株单克隆抗体混合（鸡尾酒疗法），覆盖病毒不同抗原表位，提高广谱性。
- 通过基因工程技术（如抗体人源化、噬菌体展示技术）改造小鼠抗体，降低免疫原性，提升临床应用潜力（如被动免疫治疗）。

六、典型案例参考

抗 CSFV E2 蛋白单克隆抗体：针对 E2 糖蛋白的单克隆抗体（如 3H4、2G10 等株）是目前猪瘟诊断的常用工具，可识别 E2 蛋白上的线性或构象表位，在病毒中和及抗原检测中表现出高特异性。
中和性单克隆抗体筛选：通过病毒中和试验筛选出的 mAb，可用于评估 CSFV 毒株的致病性，或作为中和活性标准品用于疫苗效力评价。