I. 介绍
本实验步骤描述了在MANTIS®液体处理器上使用SMART-Seq单细胞试剂盒(SSsc kit, Cat. # 634472)进行 四分之一体积的反应，从384孔板的单细胞中生成cDNA。

II. 概论

• 使用SSsc试剂盒进行384次反应，精确计算如下试剂体积，为了确保有足够的试剂进行384次四分之一 体积的反应，请务必遵守LV、HV芯片的灌注和预分配体积。

• LV芯片灌注体积= 5.4 μl
• LV芯片预分配体积为=1.2 μl
• HV芯片灌注体积=12 μl
• HV芯片预分配体积=5 μl

• 每一个新的添加物使用一个新的芯片。在一天运行结束后，按照相应的洗涤步骤清洗所有LV和HV芯 片。

• 注意避免在整个过程中出现气泡。 

• 有关SMART-Seq单细胞套件的更多信息，请参阅SMART-Seq单细胞套件用户手册。

III. 实验步骤

A. 用于细胞分选的384孔板的制备

1. 为了制作CDS分选溶液(CSS)，首先手动注入114μl 10X裂解缓冲液到1.5 ml无核酸酶管中。

2. 添加6μl核糖核酸酶抑制剂(40 U /μl)，通过缓慢混合后快速旋转试剂。

3. 将120μl的3’SMART-Seq CDS Primer II A加入到10X反应缓冲液中(总体积为60μl)。

4. 加1,260μl无核酸酶水(总体积1,500μl)。

5. 缓慢旋转混合物。

6. 将750μl的CSS注入两个1000μl的吸管剪短，并将尖端装入LVMANTIS芯片(位置1和2)。通过对 MANTIS液体处理器编写程序，从选择的位置添加3.2μl CSS到每个孔中。

注:在本实验方案中，我们假设FACS对细胞的分选不会改变板孔中液体的体积。如果分选机分配了不可忽略体积的鞘液 量，可通过减少无核酸酶水的量来调整CSS混合物的体积，使其总体积保持在3.2μl /孔。

安全停止点：孔板可在-20°C保存过夜。

B. 细胞分类

1. 将细胞直接注入含有CSS的板孔中。

2. 分类完成后，将孔板密封，并将其快速旋转，使细胞到达孔的底部。

3. 立即将孔板放置于干冰上约5分钟，然后转移到-80°C的冰箱。

 

安全停止点：孔板可在-80°C保存过夜。
C. 低聚糖退火
1. 从-80°C的冰箱中取出孔板，让它解冻约1分钟，并轻微旋转。然后，向下旋转孔板，收集孔底的 内容物。
2. 将孔板转移到预热过的热循环器中，在72°C孵化3分钟。
3. 孵化3分钟后，放置到冰块上2分钟。
4. 当孔板放在冰上时，准备RT反应混合液(D部分)。

D. RT反应混合液的制备
1. 将下列试剂按如下顺序室温添加到1.5 ml无核酸酶管中，制备足够的RT反应混合物，进行384次 反应。务必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆转录酶，上下轻轻混合。

*该图表详细说明了每种成分进行384次反应所需的量(相当于一孔板的量)，包括以计算移液误差的补充体积。

2. 在1,000μl的移液管吸头加入804μl的RT反应混合也，装入LV MANTIS MANTIS液处理器编程，将1.9μl的RT反应混合液加入到选择的孔中。

3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。

4. 以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。

E. 第一链的合成

1. 将孔板从D部分转移到一个预热的热循环器中，并运行以下程序

2. 程序完成后，以每分钟2000转的速度旋转平板30-60秒。
安全停止点：孔板可在4°C保存过夜。

F. PCR扩增cDNA
1. 将以下试剂按照顺序加入到2.0 ml冰管中，准备足够的384个反应的PCR反应混合液。请务必在 使用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶，上下轻轻混合。

 

*该图表详细说明了每种成分进行384次反应所需的量(相当于一孔板的量)，包括以计算移液误差的补充体积。

2. 在6个1000μl的移液管吸头加入1030μl PCR主混合液，将每个吸头装入HV MANTIS 芯片(位置 1-6)。每1000μl的移液器吸头，使用MANTIS液体处理器编程，在E阶段制备的孔板每孔中加入 15μl的PCR主混合液。

3. 用封口胶带密封孔板，收集试剂，轻轻旋转3-5次孔板。

4. 以每分钟2000转的速度旋转孔板30-60秒。

5. 将孔板转移到预热过的热循环器中，运行以下程序:

 

*使用以下表格作为指导，以帮助确定输入的最佳PCR循环次数:

安全停止点：孔板可在4°C保存过夜。

G. 用NucleoMag NGS纯化及片段选择纯化扩增的cDNA

cDNA可以通过NucleoMag NGS的纯化及片段选择(Takara Bio, 744970.5, 744970.50，或 744970.500)纯化。

注：NucleoMag NGS的纯化及片段选择磁珠悬浮可以用等量的agcourt AMPure XP磁珠代替。

1. 每次使用前，取适量置于室温下至少30分钟，搅拌均匀即可。

2. 每次实验准备新鲜的80%乙醇。每个样品需要100μl。

3. 需要一个能容纳384孔板的磁力分离架。

4. 将NucleoMag NGS的纯化及片段选择磁珠混合均匀，然后在每个样品中加16μl。

5. 通过轻轻旋转或上下摇晃移液至少10次，彻底混合。

6. 室温孵化8分钟，让cDNA与磁珠结合。

7. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约5分钟或更长时间，直 至液体完全清澈，上清液中无磁珠残留。

8. 当样品放在磁力分离架上时，用移液管移去上清液并丢弃。

9. 把样品放在磁力分离架上。每个样品添加50μl新鲜配制的80%乙醇，不干扰磁珠。等待30秒后， 小心移去含有污染物的上清液。在清洗过程中， cDNA将继续结合在磁珠上。

10. 重复乙醇清洗(步骤9)一次。

11. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上30秒，然后用吸管除去所 有剩余的乙醇。

12. 在室温下放置样品约2-2.5分钟，直到颗粒不再有光泽，但在裂纹出现之前。

13. 待磁珠干燥后，加17μl的洗脱缓冲液盖住磁珠。从磁力分离架中取出样品，彻底混合，重新悬浮磁珠。

14. 室温孵化2分钟以补水。

15. 轻轻地旋转样品，从样品孔的侧面收集液体。将样品放在磁力分离架上约1分钟或更长时间，直 至液体完全清澈。

16. 将含有纯化cDNA的上清液从每个孔转移到无核酸酶，低粘附力的管中。在每个试管上贴上样品 信息标签，并在-20°C保存，直到库准备好。

安全停止点：孔板可在-20°C保存过夜。

17. 参考SMART-Seq Single Cell Kit用户手册，了解量化和库准备选项。