虾原肌球蛋白（Tropomyosin）是虾肉中主要的过敏原和结构蛋白，其提取制备需结合肌肉组织特性与蛋白理化性质，以下为科学严谨的制备流程，涵盖从原料处理到纯化鉴定的全步骤：

一、原料选择与预处理
1. 原料来源
优选新鲜虾类（如凡纳滨对虾、中国对虾）的肌肉组织，避免冷冻解冻损伤蛋白结构，鲜活虾需在冰浴中迅速解剖，剥离胸腹部肌肉（去除结缔组织和脂肪）。
原料量：100 g 虾肉可提取约 1~2 mg 原肌球蛋白（视纯度而定）。

2. 组织破碎与初步提取
步骤 1：匀浆处理
虾肉用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤 3 次，去除血液和杂质，按 1:5（w/v）加入含 0.1 mM PMSF（蛋白酶抑制剂）的 PBS，用组织匀浆器在冰浴下破碎（20000 rpm，30 秒 ×3 次，间隔 30 秒）。

步骤 2：盐溶液提取
匀浆液中加入 NaCl 至终浓度 0.6 M（促进肌原纤维蛋白溶解），4℃搅拌提取 2 小时，12000 rpm 离心 30 分钟，收集上清（含肌球蛋白、原肌球蛋白等肌原纤维蛋白）。

二、粗提：分离肌原纤维蛋白
1. 沉淀除杂蛋白
向上清液中缓慢加入固体硫酸铵至 30% 饱和度，4℃静置 1 小时，10000 rpm 离心 20 分钟，弃沉淀（含部分杂蛋白），上清液继续加硫酸铵至 50% 饱和度，静置 1 小时后离心，沉淀为肌原纤维蛋白混合物（含原肌球蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白等）。

2. 低盐溶解与透析
沉淀用少量低盐缓冲液（0.01 M Tris-HCl，pH 7.5，含 0.05 M NaCl）溶解，装入透析袋（截留分子量 14 kDa），在 4℃下对低盐缓冲液透析 24 小时（换液 3 次），去除硫酸铵和小分子杂质，透析后溶液即为肌原纤维蛋白粗提液。

三、纯化：利用原肌球蛋白理化特性分离
1. 热变性法初步纯化（利用热稳定性）
粗提液在 60℃水浴中加热 10 分钟（肌球蛋白等蛋白在此温度变性沉淀），立即冰浴冷却，12000 rpm 离心 20 分钟，上清液含耐热的原肌球蛋白（纯度约 50%~60%）。

2. 离子交换层析（关键纯化步骤）
柱料选择：DEAE-Sepharose Fast Flow（阴离子交换树脂），用 0.01 M Tris-HCl（pH 7.5）平衡柱子。

上样与洗脱：
热变性上清液上样后，先用平衡缓冲液洗脱未结合杂蛋白，再用 0.01~0.5 M NaCl 梯度洗脱（原肌球蛋白在 0.2~0.3 M NaCl 时洗脱），收集洗脱峰，通过 SDS-PAGE 检测纯度，合并含原肌球蛋白的组分。

3. 凝胶过滤层析（进一步提纯）
选用 Sephadex G-100 或 Superdex 75 柱，用 PBS（pH 7.4，含 0.15 M NaCl）平衡，将离子交换纯化的样品上样，以相同缓冲液洗脱，收集单一洗脱峰（原肌球蛋白分子量约 70 kDa，二聚体），SDS-PAGE 验证纯度（单一条带，分子量约 35~37 kDa 亚基）。

四、浓缩与保存
1. 浓缩
纯化后的样品通过 10 kDa 超滤管（Amicon Ultra）在 4℃下 3000 rpm 离心浓缩至 1~5 mg/mL，或用 PEG20000 透析浓缩（避免反复冻融）。

2. 保存条件
分装后加入 0.02% 叠氮钠（防腐剂），-80℃冻存（可稳定保存 6 个月以上），短期使用可 4℃保存（不超过 2 周），避免反复冻融导致蛋白变性。

五、纯度鉴定与活性验证
1. 结构鉴定
SDS-PAGE 电泳：12% 分离胶，上样 5~10 μg 蛋白，考马斯亮蓝染色应呈现单一清晰条带，亚基分子量约 35~37 kDa（二聚体约 70 kDa），与标准品比对确认。
Western blot：用抗原肌球蛋白抗体检测，验证其免疫反应性（常用于过敏原研究）。

2. 功能验证（可选）
钙结合实验：原肌球蛋白可与肌钙蛋白结合，通过荧光光谱法检测其与 Ca²⁺的结合能力（适用于功能研究）。
肌动蛋白结合实验：体外验证原肌球蛋白与肌动蛋白丝的结合（如沉降实验或荧光标记法）。

六、优化策略与注意事项
1. 关键优化点
温度控制：全程冰浴或 4℃操作，避免蛋白降解；热变性步骤需严格控制温度和时间（超过 65℃可能导致原肌球蛋白变性）。
离子强度调节：原肌球蛋白在低盐（0.05~0.1 M NaCl）条件下易与肌动蛋白结合，高盐（0.6 M）可解离，需根据步骤调整盐浓度。

2. 常见问题与解决方案
问题 原因 解决方案
纯度低 杂蛋白未有效去除 增加离子交换层析梯度洗脱步数，或联用亲和层析（如抗原肌球蛋白抗体柱）
得率低 提取过程中蛋白沉淀 优化硫酸铵沉淀饱和度（如调整至 40%~60%），或添加 1 mM MgCl₂稳定蛋白结构
活性丧失 纯化条件剧烈 避免极端 pH（＜6.0 或＞8.5），用甘油（5%~10%）保护蛋白结构

3. 应用场景
过敏原研究：制备高纯度虾原肌球蛋白用于过敏诊断（如 ImmunoCAP 检测）和疫苗开发；
结构生物学：作为晶体衍射或核磁共振（NMR）的研究材料；
食品工业：分析虾肉蛋白变性机制（如冷冻贮藏中的蛋白变化）。

七、替代方法：重组虾原肌球蛋白制备（可选）
若需更高纯度或无过敏原活性的蛋白，可通过基因工程手段：
基因克隆：从虾肌肉 cDNA 中扩增原肌球蛋白基因（如 Penaeus vannamei 的 Tm 基因），连接至 pET-28a 载体，转化 BL21 (DE3) 大肠杆菌；
诱导表达：IPTG 诱导重组蛋白表达（37℃，4 小时），超声破碎后用镍柱亲和层析纯化（His 标签标记），经肠激酶切除标签后获得重组蛋白（纯度＞95%）。