NETosis Drives Blood Pressure Elevation and Vascular Dysfunction in Hypertension

Keywords: extracellular traps; histones; hypertension; neutrophils; protein-arginine deiminase type 4.

高血压是心血管疾病最重要的可改变危险因素。中性粒细胞在先天免疫反应中起重要作用，是人体循环中最丰富的白细胞。在人类高血压中，中性粒细胞计数增加。中性粒细胞还通过称为 NETosis的过程形成中性粒细胞外诱捕网（NETs）去杀死病原体。NETs 具有促炎性，并在许多疾病条件下的免疫激活和炎症中发挥作用。在人类和啮齿动物高血压模型中，肾脏和主动脉等外周组织的 NETosis 增强，NETs 也存在于高血压大鼠和小鼠模型的肠系膜血管中。此外，NETs 还促进动脉粥样硬化和血栓形成，并有助于血小板的活化。

肽酰精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）是一种位于中性粒细胞细胞核中的钙依赖性酶，能催化瓜氨酸化组蛋白H3（H3-Cit）导致染色质解聚，这是NETs形成的关键因素。H3-Cit 已被证明可以破坏微血管内皮细胞（ECs）屏障。

机械敏感钙通道 TRPV4（瞬时受体电位阳离子通道亚家族V 成员4）在中性粒细胞中高度表达。在急性肺损伤模型中，抑制 TRPV4 会减弱中性粒细胞 ROS 的产生、粘附和趋化性。用 TRPV4 激动剂GSK1016790A处理中性粒细胞则以剂量依赖性方式增加 ROS 的产生。

基于这些发现，美国范德堡大学生物医学工程系、麻醉学系及医学中心临床药理学部研究团队假设 NETosis 导致 EC 激活和血管功能障碍，从而导致高血压。观察结果确定了 NETosis 在高血压发病机制中的作用。研究成果发表于Circulation Research 期刊题为“NETosis Drives Blood Pressure Elevation and Vascular Dysfunction in Hypertension”。



首先，为了确定 Padi4 在高血压小鼠免疫细胞亚群中的表达，检测了用血管紧张素II（Ang II）处理的小鼠脾细胞的单细胞测序数据，发现Padi4 表达在中性粒细胞簇中富集，在其他细胞类型中低表达。为了确定 PAD4 在高血压中的作用，用Ang II处理 Padi4−/−或 C57Bl/6 对照小鼠，测量收缩压、舒张压和平均动脉压。Padi4−/− 小鼠在第 1 周发展为高血压，并在接下来的 3 周内表现出收缩压、舒张压和平均动脉压的降低。这说明，PAD4 的缺失减轻了 Ang II 诱导的高血压。

为了评估 NETosis 对血管反应性的作用，采集肠系膜动脉并确定血管功能。结果未观察到对硝普钠的反应差异，然而，Padi4−/− 小鼠对乙酰胆碱的反应改善了血管松弛（图1 A、B）。为了评估肾脏钠和水含量，小鼠在Ang II 处理后注射生理盐水注射，并测量尿量，发现 Padi4−/− 小鼠肾脏钠和容量排泄提高的趋势（图1 C）。此外，与C57Bl/6小鼠相比，Padi4−/− 小鼠的中性粒细胞、树突状细胞和细胞毒性 CD8+ T细胞浸润明显减少（图1 D-F）。这些结果表明，Padi4−/− 小鼠表现出内皮依赖性血管松弛改善和主动脉炎症减少。
 

图1 NET-缺陷小鼠对Ang II的反应改善了内皮细胞功能，减少了血管炎症。

接下来，收集原代 C57Bl/6 中性粒细胞，与C57Bl/6 小鼠主动脉 ECs共培养或单独培养 18 小时。培养的内皮细胞暴露于正常血压（5%）或高血压（10%）单轴循环拉伸。在没有 ECs 的情况下，10% 的拉伸会增加 NETosis。然而，在共培养后，与单独培养的中性粒细胞相比，当以 5% 或 10% 的拉伸暴露于 ECs 时，中性粒细胞表现出增加的 NETosis。与5% 拉伸或单独培养的中性粒细胞相比，10% 的拉伸以叠加效应增强共培养中的 NETosis。此外，与 C57Bl/6 中性粒细胞相比，Padi4−/− 中性粒细胞与10% 拉伸暴露的 ECs 共培养导致最少的细胞外 DNA 分泌和 NET 形成。这表明，中性粒细胞与内皮细胞的共培养以及高血压牵张暴露会增加 NETosis。

进一步地，中性粒细胞与 ECs 共培养 36 小时。与单独培养中性粒细胞相比，与ECs 共培养显著提高了细胞存活率。验证在 ECs 存在下拉伸的效果，发现与 5% 的拉伸相比，10% 的拉伸增加了共培养中的 NETosis（图2 A、B）。细胞活力评估显示，与 5% 拉伸相比，10% 拉伸时自杀性 NETosis 增加（图2 C、E）。
 

图2 在内皮细胞存在的情况下，长期高血压拉伸会增加自杀性 NETosis。

最后，收集与 ECs 共培养并暴露于 5% 或 10% 拉伸的中性粒细胞，通过 Western blot 评估 H3-cit。与 5% 拉伸相比，暴露于 10% 拉伸的中性粒细胞表现出 H3-Cit 增加。此外，观察到暴露于 H3-Cit 的 ECs 中 Icam1、Vcam1、Sell 和 Sele 的表达显著增加。主动脉环暴露于细胞外组蛋白 H3 或 H3-cit 减弱了响应乙酰胆碱的血管松弛反应。与暴露于对照的拉伸细胞相比，ECs 暴露于 10% 拉伸和 H3-Cit 显著增加了炎性细胞因子 Il6、Tgfβ 和 Tnfα 的表达。这说明，高血压拉伸增加中性粒细胞H3-Cit，H3-Cit暴露导致 EC 激活、血管功能障碍和炎性细胞因子表达。

然后，为了确定机械敏感钙通道 TRPV4 的激活是否会增加中性粒细胞细胞内钙水平，分离的小鼠中性粒细胞分别用1、10和100 nM的特异性TRPV4激动剂 GSK1016790A处理。结果观察到，GSK1016790A处理后细胞内钙呈剂量依赖性增加（图3 A、B）。为了确定 TRPV4 激动作用是否刺激 H3-Cit 产生和 NETosis，用 GSK1016790A 处理中性粒细胞，并通过免疫荧光评估 H3-Cit 和 NET 的形成，发现 H3-Cit 和 NETosis 呈剂量依赖性增加，且在 100 nmol/L 时显著增加（图3 C-E）。这说明，TRPV4 的激活增加中性粒细胞胞内钙水平并增加 NETosis。

图3 中性粒细胞中的 TRPV4 激活可增强细胞内钙和 NETosis。

图4 图形概要

总之，该研究表明 NETosis 会导致高血压、主动脉炎症和高血压中的 EC 功能障碍。此外，还表明内皮细胞拉伸是高血压的标志，是 NETosis 的直接驱动因素。鉴于 NETs 作为心血管疾病的重要因素，高血压对 NETosis 的影响可能有助于这些疾病的发展和进展。

参考文献：Krishnan J, Hennen EM, Ao M, Kirabo A, Ahmad T, de la Visitación N, Patrick DM. NETosis Drives Blood Pressure Elevation and Vascular Dysfunction in Hypertension. Circ Res. 2024 May 24;134(11):1483-1494. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.123.323897. Epub 2024 Apr 26. PMID: 38666386; PMCID: PMC11116040.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38666386/

IF：16.5

ISSN：0009-7330

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