一、引言

动物模型在精神神经疾病研究中具有重要价值，明暗箱实验因其操作简便、无需外部刺激等特点，已成为评估焦虑行为的金标准。该实验基于啮齿类动物趋暗避光的本能行为，通过测量明暗箱穿梭次数、停留时间等参数反映焦虑水平。研究表明，抗焦虑药物能显著增加小鼠在明亮区域的探索行为，而抑郁模型动物则表现出活动量减少等特征。然而，实验条件的微小差异可能导致结果偏差，因此有必要对影响实验结果的系统性因素进行深入探讨。

现有研究多聚焦单一变量影响，缺乏多因素交互作用的系统分析。光照作为核心环境因子，其波长、强度及空间分布均可能影响动物行为表现。此外，昼夜节律作为内源性生物钟，与光照条件共同调控生理节律，二者协同作用对情绪行为的影响尚未明确。本研究通过构建多维度实验体系，系统解析各因素对焦虑行为的影响权重，为实验标准化提供理论依据。

 

二、材料与方法

（一）实验装置

实验采用定制化明暗箱系统，箱体主体采用医用级ABS材料，分为明室（30×27×27 cm³）与暗室（18×27×27 cm³），中间设置可拆卸隔板。明室顶部配置30W可调白光LED光源，照度范围0-1200lux；暗室配备30W红色LED灯（波长620-750nm），底部照度恒定2lux。箱体内部安装红外摄像系统，配备850nm红外滤镜及平行光源，采样频率30fps。行为分析软件采用EthoVision XT 16，通过阈值分割与质心追踪技术提取行为参数。

 

二）实验动物

SPF级昆明小鼠84只，雄性，6-8周龄，体重22±2g。动物适应性饲养1周后随机分组，每组6只。实验遵循NIH动物福利指南，所有操作经伦理委员会批准（编号：SYXK-2022-001）。

（三）实验设计

采用4×2析因设计，考察昼夜节律（白天18:00-6:00；黑夜6:00-18:00）、光照面积（大面积箱体3/5；小面积箱体2/5）两因素对焦虑行为的主效应及交互作用。光照颜色实验设置黄、绿、蓝、红四种波长（λ=580nm、530nm、470nm、620nm），光照强度实验采用15W、25W、40W、60W、100W梯度功率。每组实验重复6次，每次测试时长5分钟。

（四）行为参数采集

记录以下核心指标：①基础行为：明暗箱停留时间百分比（Ltime%、Dtime%）、穿梭次数（Transition）、水平运动得分（Cross）、垂直运动得分（Rear）；②运动特征：总路程（Total Distance）、平均速度（Average Speed）、加速度（Acceleration）；③焦虑相关指标：排便粒数（Fecal Pellets）、修饰次数（Grooming）。采用双盲法进行数据采集与分析，实验间隔期间使用75%乙醇彻底清洁箱体。

三、结果

（一）昼夜节律与光照面积交互作用

白天周期中，大箱组Ltime%（38.7±4.2% vs 32.1±3.8%）、Cross（12.4±1.8 vs 9.8±1.5）显著高于小箱组（p<0.05），提示空间大小对日间探索行为具有放大效应；夜间则呈现相反趋势，小箱组Total Distance（823.6±98.7 cm vs 745.3±89.4 cm）和Rear（4.2±0.6 vs 3.5±0.5）显著增加（p<0.05）。析因分析显示昼夜节律与光照面积存在显著交互作用（F=4.32, p=0.016）。

（二）光照颜色效应

黄光组表现出独特的焦虑样表型：Ltime%（28.4±3.1%）显著低于蓝光组（35.6±4.2%），而Defecation（5.2±0.8 pellets）却高于绿光组（3.8±0.6 pellets）。光谱分析表明，黄光波长（580-600nm）可能通过视网膜ipRGCs通路影响SCN核团活动，进而调节情绪相关神经递质释放。

（三）光照强度剂量效应

在15-100W范围内，Cross次数呈现倒U型曲线，峰值出现在40W组（14.2±1.9次），低强度组（15W）和高强度组（100W）分别下降至9.6±1.3次和10.8±1.6次。这种非线性关系提示存在最佳刺激强度窗口，可能与视网膜感光细胞的适应性调节机制有关。

四、讨论

本研究首次系统揭示了昼夜节律与光照面积的交互作用机制，发现大空间在白天更能诱发焦虑样行为，这与人类"幽闭恐惧症"的空间认知特性形成有趣对照。光照颜色的研究发现黄光具有独特的焦虑诱导效应，这为理解季节性情感障碍的光周期治疗提供了新视角。光照强度的倒U型曲线证实了环境刺激的"金发姑娘原则"，过度刺激反而抑制行为表现。

实验设计的创新点体现在三个方面：①采用析因设计全面解析多因素交互作用；②引入高精度红外追踪系统实现行为自动化分析；③构建标准化实验流程提升结果可比性。这些改进有效降低了操作误差，提高了数据可靠性。未来可结合光遗传学技术进一步解析特定脑区在光照调控中的作用机制。

五、结论

明暗箱实验的优化需综合考虑昼夜节律、光照参数等多维度因素。本研究表明：①白天使用大面积箱体更利于检测焦虑样行为；②黄光波长具有特异性焦虑诱导效应；④40W光照强度为行为激发的最佳阈值。这些发现为建立标准化的焦虑模型提供了重要参考，同时也为临床光疗方案的制定提供了实验依据。