切向流过滤技术在外泌体研究中的应用_abio生物试剂品牌网
在生命科学领域，外泌体的研究逐渐成为热点，而它在实际生活中对人们的影响也是多方面的。从癌症的早期检测到免疫调节，外泌体的应用已经渗透到医疗健康的方方面面。例如，研究发现，外泌体可以携带特定的miRNA，用于癌症的无创诊断；它们还能通过调节免疫系统，帮助治疗炎症性疾病。
此外，外泌体在护肤领域也展现出惊人的潜力，它们能够激活成纤维细胞，促进胶原蛋白合成，平衡基质金属蛋白酶的活性，维持胶原蛋白生成与降解的动态平衡，从而延缓皮肤衰老迹象。外泌体的抗氧化特性可减少自由基对细胞DNA的损伤，起到保护作用，还能提高细胞能量利用效率和代谢活性，从根本上改善细胞健康状态。临床数据表明，外泌体处理后，皮肤厚度增加19.3%，皱纹减少23.6%，弹性增加31.4%，使用4-8周后效果尤为明显。然而，要真正释放外泌体的潜力，首先需要高效、纯净的分离技术，而这正是切向流过滤技术的用武之地。
了解外泌体 外泌体是细胞外囊泡的一种，直径在30-150纳米之间，几乎所有类型的细胞均可分泌，它们富含胆固醇、鞘磷脂以及多种生物分子，包括蛋白质、mRNA和miRNA。这些分子不仅具有生物活性，还能在进入靶细胞后调节其功能。例如，研究发现，间充质干细胞分泌的外泌体可以通过携带miRNA，增强中性粒细胞的活性，从而在炎症反应中发挥作用。
然而，外泌体的提取和纯化一直是研究中的瓶颈。传统的超速离心法虽然能够获得大量外泌体，但纯度较低，且容易破坏外泌体的完整性。而切向流过滤技术的出现，为这一难题提供了突破性的解决方案。
常见的外泌体提取方法及特点 目前外泌体提取方法主要有超速离心、SEC尺寸排阻、磁珠捕获、超滤和切向流过滤（TFF）等方法。
根据样品中外泌体与其他成分在尺寸和密度上的差异，通过一系列不同离心力和离心时间的超速离心步骤，逐步去除非外泌体成分，最终将外泌体沉淀并重新悬浮。
优点：去除了大部分污染物，分离得到的外泌体较纯净；适用于大体积样本（如细胞培养上清、血清等）；无需额外试剂，避免了化学试剂的污染。
缺点：需要超速离心机，设备昂贵，操作复杂；高离心力可能导致外泌体结构损伤，影响其完整性；回收率较低，部分外泌体可能无法有效沉淀
尺寸排阻法是利用多孔球状填料形成色谱柱，样本流经色谱柱时，不同尺寸的分子以不同速率流出。外泌体（30-150 nm）介于大蛋白与细胞外囊泡之间，可在特定洗脱体积内被收集。
优点：耗时短，操作简单，无需特殊设备；重复性好且回收率高；操作温和，最大程度保持胞外囊泡的完整形态结构。
缺点：样本会被稀释，纯度受限，不适用于超大体积的样本。
磁珠捕获法是利用抗体修饰的磁珠特异性捕获外泌体，通过磁力来进行分离。
优点：是目前分离外泌体纯度最高的方法，特异性高；可排除游离核酸干扰
缺点：价格较贵，产品受抗原表达影响
超滤离心法是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜进行选择性分离，小分子物质会被过滤到膜的另一侧，而大于膜孔径的高相对分子质量物质则截留在超滤膜上。
优点：这种方法比较简单高效，可在短时间内将样本浓缩10-30倍，也不影响外泌体的生物活性。
缺点：外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低；截留在膜上的外泌体间也会产生粘附，纯度不高。
以上几种是常见的外泌体提取方法的特点，关于TFF提取法会再下面详细讲解。 切向流过滤技术：外泌体分离的革新者 （一）保护外泌体完整性
外泌体是一种纳米尺寸的柔性颗粒，其脆弱的脂质包膜使其在分离过程中极易受到损伤。传统的超速离心法在长时间的高速旋转过程中会产生较大的剪切力，可能破坏外泌体的结构，导致其内部生物分子的泄漏，从而影响外泌体的生物学活性和后续研究。
切向流过滤技术则通过轻柔的切向作用使外泌体流过分离界面，外泌体不直接受到流体的挤压，极大地减小了对外泌体等柔性结构的破坏，能够有效保护外泌体的完整性和生物学活性，确保外泌体在分离后仍能保持其原有的功能和特性，为后续的研究和应用提供可靠的样本。
（二）高效分离与浓缩
在处理大体积样本时，切向流过滤技术的高效性尤为突出。它能够在较短的时间内完成外泌体的分离和浓缩，大大提高了工作效率。通过增加滤液与纳米多孔膜的接触面积，切向流过滤技术可以使外泌体更快速地通过合适孔径的过滤膜，实现与其他杂质的分离。同时，该技术还能避免膜的堵塞，使得整个分离过程更加顺畅高效。
相比之下，传统的超速离心法需要多次离心步骤，操作繁琐且耗时较长，而且在离心过程中还可能导致外泌体的损失。对于需要大量外泌体样本的科研项目，如外泌体药物研发，以及临床应用中的大规模外泌体生产来说，切向流过滤技术的高效性无疑具有巨大的优势。
（三）广泛的样本适用性
切向流过滤技术适用于多种来源的样本，无论是血液、尿液等复杂的体液样本，还是细胞培养液等相对简单的样本，都能实现外泌体的有效分离。不同类型的样本其成分和性质差异较大，传统的单一分离方法很难满足所有样本的需求。而切向流过滤技术凭借其灵活的参数调整能力和独特的工作方式，能够适应各种复杂的样本环境，稳定地实现外泌体的分离，为外泌体在不同领域的深入研究和应用提供了有力支持。
（四）膜形式的选择
外泌体纯化到底是选择中空纤维膜柱还是盒式膜包？
1. 中空纤维膜柱（Hollow Fiber Cartridge）
特点：
低剪切力：切向流过滤（TFF）设计减少流体剪切力，适合保护外泌体完整性。
高处理量：适合大体积样本（如生物反应器培养液、血清等），支持连续循环浓缩。
可重复性：膜表面积大，堵塞风险较低，适合长期或多次使用。
2. 盒式膜包（Cassette）
特点：
快速处理：开放式流道设计，流速快。
操作简便：安装和清洗相对简单，适合实验室常规使用。
灵活性：可灵活更换不同截留分子量（MWCO）的膜，适配不同粒径的外泌体。
通过以上特点对比，优先选择中空纤维膜，剪切力低，流道宽，适合处理高浓外泌体浓缩液，可放大生产。
（五）常见操作步骤
第一步澄清，用0.2um或0.45um孔径的膜包或中空纤维柱，通过TFF操作，大于膜孔径的细胞碎片或颗粒保存在截留液，外泌体在透过液；
第二步浓缩和换液，使用100 kDa~500kDa MWCO的中空纤维（可以依据具体实验要求选择不同分子量大小）进一步浓缩换液，去除小分子如蛋白类物质；我公司的自动超滤设备可以通过检测和维持特定跨膜压，最大限度减小外泌体的结构损伤，保持外泌体功能的完整性。
（六）关键参数优化
1、跨膜压力（TMP）：
过高压力导致膜污染和外泌体破裂，建议 <15 psi（需根据膜类型预实验优化）。
2、剪切力控制：
降低泵流速或选择低剪切力膜（如中空纤维膜柱）。
3、温度：
全程在 4℃ 操作以减少外泌体降解（尤其对活性要求高的实验）。
切向流过滤技术凭借其在保护外泌体完整性、高效分离与浓缩以及广泛的样本适用性等方面的优势，成为外泌体研究和应用中不可或缺的工具。随着技术的不断发展和完善，切向流过滤技术将为外泌体在疾病诊断、治疗和药物递送等领域的应用提供更强大的支持，推动生命科学领域的进一步发展，为人类健康带来更多的福祉。
此外，外泌体在护肤领域也展现出惊人的潜力，它们能够激活成纤维细胞，促进胶原蛋白合成，平衡基质金属蛋白酶的活性，维持胶原蛋白生成与降解的动态平衡，从而延缓皮肤衰老迹象。外泌体的抗氧化特性可减少自由基对细胞DNA的损伤，起到保护作用，还能提高细胞能量利用效率和代谢活性，从根本上改善细胞健康状态。临床数据表明，外泌体处理后，皮肤厚度增加19.3%，皱纹减少23.6%，弹性增加31.4%，使用4-8周后效果尤为明显。然而，要真正释放外泌体的潜力，首先需要高效、纯净的分离技术，而这正是切向流过滤技术的用武之地。
了解外泌体 外泌体是细胞外囊泡的一种，直径在30-150纳米之间，几乎所有类型的细胞均可分泌，它们富含胆固醇、鞘磷脂以及多种生物分子，包括蛋白质、mRNA和miRNA。这些分子不仅具有生物活性，还能在进入靶细胞后调节其功能。例如，研究发现，间充质干细胞分泌的外泌体可以通过携带miRNA，增强中性粒细胞的活性，从而在炎症反应中发挥作用。
然而，外泌体的提取和纯化一直是研究中的瓶颈。传统的超速离心法虽然能够获得大量外泌体，但纯度较低，且容易破坏外泌体的完整性。而切向流过滤技术的出现，为这一难题提供了突破性的解决方案。
常见的外泌体提取方法及特点 目前外泌体提取方法主要有超速离心、SEC尺寸排阻、磁珠捕获、超滤和切向流过滤（TFF）等方法。
- 超速离心法
根据样品中外泌体与其他成分在尺寸和密度上的差异，通过一系列不同离心力和离心时间的超速离心步骤，逐步去除非外泌体成分，最终将外泌体沉淀并重新悬浮。
优点：去除了大部分污染物，分离得到的外泌体较纯净；适用于大体积样本（如细胞培养上清、血清等）；无需额外试剂，避免了化学试剂的污染。
缺点：需要超速离心机，设备昂贵，操作复杂；高离心力可能导致外泌体结构损伤，影响其完整性；回收率较低，部分外泌体可能无法有效沉淀
- SEC尺寸排阻法
尺寸排阻法是利用多孔球状填料形成色谱柱，样本流经色谱柱时，不同尺寸的分子以不同速率流出。外泌体（30-150 nm）介于大蛋白与细胞外囊泡之间，可在特定洗脱体积内被收集。
优点：耗时短，操作简单，无需特殊设备；重复性好且回收率高；操作温和，最大程度保持胞外囊泡的完整形态结构。
缺点：样本会被稀释，纯度受限，不适用于超大体积的样本。
- 磁珠捕获法
磁珠捕获法是利用抗体修饰的磁珠特异性捕获外泌体，通过磁力来进行分离。
优点：是目前分离外泌体纯度最高的方法，特异性高；可排除游离核酸干扰
缺点：价格较贵，产品受抗原表达影响
- 超滤法
超滤离心法是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜进行选择性分离，小分子物质会被过滤到膜的另一侧，而大于膜孔径的高相对分子质量物质则截留在超滤膜上。
优点：这种方法比较简单高效，可在短时间内将样本浓缩10-30倍，也不影响外泌体的生物活性。
缺点：外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低；截留在膜上的外泌体间也会产生粘附，纯度不高。
以上几种是常见的外泌体提取方法的特点，关于TFF提取法会再下面详细讲解。 切向流过滤技术：外泌体分离的革新者 （一）保护外泌体完整性
外泌体是一种纳米尺寸的柔性颗粒，其脆弱的脂质包膜使其在分离过程中极易受到损伤。传统的超速离心法在长时间的高速旋转过程中会产生较大的剪切力，可能破坏外泌体的结构，导致其内部生物分子的泄漏，从而影响外泌体的生物学活性和后续研究。
切向流过滤技术则通过轻柔的切向作用使外泌体流过分离界面，外泌体不直接受到流体的挤压，极大地减小了对外泌体等柔性结构的破坏，能够有效保护外泌体的完整性和生物学活性，确保外泌体在分离后仍能保持其原有的功能和特性，为后续的研究和应用提供可靠的样本。
（二）高效分离与浓缩
在处理大体积样本时，切向流过滤技术的高效性尤为突出。它能够在较短的时间内完成外泌体的分离和浓缩，大大提高了工作效率。通过增加滤液与纳米多孔膜的接触面积，切向流过滤技术可以使外泌体更快速地通过合适孔径的过滤膜，实现与其他杂质的分离。同时，该技术还能避免膜的堵塞，使得整个分离过程更加顺畅高效。
相比之下，传统的超速离心法需要多次离心步骤，操作繁琐且耗时较长，而且在离心过程中还可能导致外泌体的损失。对于需要大量外泌体样本的科研项目，如外泌体药物研发，以及临床应用中的大规模外泌体生产来说，切向流过滤技术的高效性无疑具有巨大的优势。
（三）广泛的样本适用性
切向流过滤技术适用于多种来源的样本，无论是血液、尿液等复杂的体液样本，还是细胞培养液等相对简单的样本，都能实现外泌体的有效分离。不同类型的样本其成分和性质差异较大，传统的单一分离方法很难满足所有样本的需求。而切向流过滤技术凭借其灵活的参数调整能力和独特的工作方式，能够适应各种复杂的样本环境，稳定地实现外泌体的分离，为外泌体在不同领域的深入研究和应用提供了有力支持。
（四）膜形式的选择
外泌体纯化到底是选择中空纤维膜柱还是盒式膜包？
1. 中空纤维膜柱（Hollow Fiber Cartridge）
特点：
低剪切力：切向流过滤（TFF）设计减少流体剪切力，适合保护外泌体完整性。
高处理量：适合大体积样本（如生物反应器培养液、血清等），支持连续循环浓缩。
可重复性：膜表面积大，堵塞风险较低，适合长期或多次使用。
2. 盒式膜包（Cassette）
特点：
快速处理：开放式流道设计，流速快。
操作简便：安装和清洗相对简单，适合实验室常规使用。
灵活性：可灵活更换不同截留分子量（MWCO）的膜，适配不同粒径的外泌体。
通过以上特点对比，优先选择中空纤维膜，剪切力低，流道宽，适合处理高浓外泌体浓缩液，可放大生产。
（五）常见操作步骤
第一步澄清，用0.2um或0.45um孔径的膜包或中空纤维柱，通过TFF操作，大于膜孔径的细胞碎片或颗粒保存在截留液，外泌体在透过液；
第二步浓缩和换液，使用100 kDa~500kDa MWCO的中空纤维（可以依据具体实验要求选择不同分子量大小）进一步浓缩换液，去除小分子如蛋白类物质；我公司的自动超滤设备可以通过检测和维持特定跨膜压，最大限度减小外泌体的结构损伤，保持外泌体功能的完整性。
（六）关键参数优化
1、跨膜压力（TMP）：
过高压力导致膜污染和外泌体破裂，建议 <15 psi（需根据膜类型预实验优化）。
2、剪切力控制：
降低泵流速或选择低剪切力膜（如中空纤维膜柱）。
3、温度：
全程在 4℃ 操作以减少外泌体降解（尤其对活性要求高的实验）。
切向流过滤技术凭借其在保护外泌体完整性、高效分离与浓缩以及广泛的样本适用性等方面的优势，成为外泌体研究和应用中不可或缺的工具。随着技术的不断发展和完善，切向流过滤技术将为外泌体在疾病诊断、治疗和药物递送等领域的应用提供更强大的支持，推动生命科学领域的进一步发展，为人类健康带来更多的福祉。
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