一、ELISA技术概述
酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于抗原抗体特异性反应的固相免疫检测技术，广泛应用于体液中微量物质的检测。它起源于20世纪70年代初，由多位学者共同推动发展，如今已成为分析化学和生物医学研究中的重要工具。

二、ELISA的核心原理
ELISA的基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合，将待测物与酶连接，再通过酶催化底物产生颜色反应，从而实现定量或定性分析。这一过程涉及抗原或抗体的固相化，以及抗原或抗体的酶标记。在检测过程中，受检标本与固相载体上的抗原或抗体发生反应，经过洗涤分离后，加入酶标记的抗原或抗体进一步结合。最终，通过酶与底物反应生成的有色产物的颜色深浅，反映标本中待测物质的含量。

三、ELISA的主要类型及操作流程
（一）双抗体夹心法
检测抗原：首先将特异性抗体固定在固相载体上，加入待测标本，使标本中的抗原与固相抗体结合。随后加入酶标记的抗体，与固相抗原抗体复合物结合。最后加入底物显色，通过比色分析确定抗原含量。此法适用于检测大分子抗原，如HBeAg、HBsAg等。

检测抗体：类似检测抗原的操作，但使用特异性抗原包被和制备酶结合物，用于检测相应抗体。

（二）间接法
主要用于检测抗体。将抗原固定在固相载体上，加入受检血清，使血清中的特异性抗体与抗原结合。再加入酶标记的抗抗体，与固相抗体结合。此法适用于传染病抗体检测，关键在于抗原的纯度。

（三）竞争法
检测抗体：标本中的抗体与酶标抗体竞争结合固相抗原，标本中抗体越多，结合的酶标抗体越少，显色越浅。

检测抗原：适用于小分子抗原或半抗原的检测，标本中抗原与酶标抗原竞争结合固相抗体。

（四）捕获法
用于检测IgM抗体，常用于传染病早期诊断。先用抗人IgM抗体捕获血清中的IgM，再加入特异性抗原和酶标抗体进行检测。

（五）亲和素-生物素系统ELISA
利用亲和素与生物素的高亲和力，提高检测的灵敏度和特异性。分为LAB法和ABC法，通过生物素标记抗体或抗原，结合亲和素和酶标生物素进行检测。

四、ELISA的特点
高灵敏度：酶的催化作用放大了免疫反应信号，可实现微量物质的检测。
强特异性：基于抗原抗体的高度特异性结合，确保检测的准确性。

五、ELISA实验材料与仪器
聚苯乙烯微量培养板
酶联免疫检测仪
辣根过氧化物酶标记抗体
包被液、稀释液、洗涤液、封闭液
底物溶液（如邻苯二胺）和终止液

六、ELISA操作步骤及要点
（一）操作步骤
包被抗原：将抗原稀释后加入培养板孔中，37℃温育1小时，4℃过夜。
洗涤：用洗涤液清洗培养板，去除未结合物质。
封闭：加入封闭液，37℃孵育1小时，防止非特异性结合。
加入标本：加入稀释后的待测血清，37℃孵育2小时。
加入酶标抗体：加入辣根过氧化物酶标记的抗体，37℃孵育1小时。
显色：加入底物溶液，室温避光反应10-15分钟。
终止反应：加入终止液，终止显色反应。
结果读取：用酶联免疫检测仪在490nm波长读取吸光值。

（二）操作要点
标本处理：血清标本应避免溶血和细菌污染，可短时间4℃保存或低温冰存。反复冻融会影响抗体效价，需分装保存。
试剂准备：严格按试剂盒说明准备试剂，使用高质量的蒸馏水或去离子水。
加样：避免气泡和交叉污染，确保加样准确。
温育：37℃温育1-2小时，确保抗原抗体充分反应。
洗涤：彻底洗涤是关键，可采用浸泡式或流水冲洗式，确保去除未结合物质。
显色与比色：显色时间需严格控制，比色时需校准仪器，选择合适波长。

七、结果判断
定性检测：通过目视或比色法判断阳性或阴性。可采用阳性判定值法或标本/阴性对照比值法。
定量检测：通过标准曲线法，根据吸光值确定标本中待测物质的浓度。

ELISA技术因其操作简便、灵敏度高、特异性强，已成为生物医学研究和临床诊断中不可或缺的工具。掌握其原理和操作要点，可有效提高检测的准确性和可靠性。

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