Fluoro-Gold双光子成像：实现小鼠脑干神经元超深度成像_abio生物试剂品牌网
在神经科学研究中，逆行神经元追踪技术是解析复杂神经环路的关键工具。自19世纪高尔基染色技术开创神经解剖学研究以来，科学家们不断探索更精准的标记方法。Fluoro-Gold（FG）作为目前最常用的荧光逆行示踪剂，凭借其高亮度、抗光漂白性及细胞质特异性标记能力，成为神经环路研究的“金标准”。然而，传统宽场荧光显微技术受限于轴向分辨率不足，无法实现深层组织的三维成像；而共聚焦显微镜因紫外激发需求与穿透深度限制，难以满足活体或厚组织样本的高分辨需求。
双光子激发显微技术（2PEM）通过近红外飞秒激光激发荧光分子，突破了光学穿透深度与空间分辨率的瓶颈，但其在FG成像中的应用长期未被系统研究。基于《Scientific Reports》最新研究成果，解析FG的双光子激发光谱与荧光寿命特性，揭示其在深层神经成像中的突破性应用，为神经退行性疾病研究与神经再生医学提供全新视角。
研究背景与技术挑战
逆行示踪剂的演进与FG的生物学特性
从早期的辣根过氧化物酶到现代荧光染料，逆行示踪技术的发展始终围绕提升标记特异性与成像效率。FG的活性成分羟基芪巴脒（OHSA）通过轴突末端摄取并逆行运输至胞体，在溶酶体中富集形成稳定标记。其荧光特性受pH调控：中性环境发射黄色荧光，酸性条件下蓝移。这种特性使其在活体与固定组织均能保持高信噪比，但传统紫外激发方案限制了其与现代显微平台的兼容性。
宽场荧光显微技术缺乏光学切片能力，共聚焦显微镜虽能实现三维重建，但受限于紫外激光器的稀缺性与组织穿透深度（通常 <100 μm）。此外，FG的广谱发射特性易与其他荧光标记物（如脂褐素自发荧光）发生串扰，导致多色成像困难。如何实现FG标记神经元的高分辨率深层成像，并解决光谱重叠问题，成为技术突破的关键。
技术创新与应用
双光子激发光谱的首次表征
研究团队通过可调谐钛宝石激光器（720-990 nm）系统测量了FG的双光子激发光谱。结果显示，FG在720 nm处呈现最大激发效率，与其单光子紫外吸收峰（350 nm）呈近似倍频关系。这一发现填补了FG光学特性的空白，为双光子成像参数优化提供了直接依据。值得注意的是，在脑组织背景下，760 nm激发可最大化FG与自发荧光的信噪比，提示波长选择需兼顾组织光学特性。
通过时间相关单光子计数技术，研究者测得 FG的荧光寿命呈双指数分布：快速衰减组分（<100 ps）与慢速组分（2.3 ns），平均寿命为1.4 ns。相较于脂褐素（1.3 ns），FG的寿命差异虽小，但通过FLIM仍可实现有效分离。这种基于寿命对比的策略，为多标记实验中消除背景干扰提供了新思路，尤其适用于神经退行性疾病研究中病理蛋白共定位分析。
折射率匹配提升成像深度
针对厚组织光散射问题，研究采用甘油浸没物镜结合商用折射率匹配液，使全脑干样本的成像深度突破 450 μm。相较于水浸物镜（150 μm极限），该方案通过减少球差与光衰减，实现了近乎单细胞分辨率的深层成像。这一技术路径为全器官尺度神经环路重建奠定了基础。
成像实验与结果分析
高分辨率三维重建与亚细胞结构解析
在面神经运动核标记实验中，双光子成像清晰展现了神经元胞体、树突及胞内囊泡结构。相较于宽场成像的模糊轮廓，2PEM可分辨直径<1 μm的树突棘，为突触可塑性研究提供形态学量化基础。通过机器学习驱动的三维分割算法，研究者实现了自动化的细胞计数与空间分布统计，效率较传统切片法提升十倍以上。
研究进一步将FG与FR分别标记面神经不同分支，成功区分相邻运动亚核的投射特异性。结合FLIM技术，双光子平台可同步解析多色标记信号，为神经环路拓扑图谱绘制提供工具。此外，FG与免疫组化及组织透明化技术的兼容性（如CLARITY），预示其在跨尺度成像中的广泛应用潜力。
总结与展望
FG的双光子特性表征标志着神经成像技术的重要突破。通过优化激发波长（720 nm）与折射率匹配方案，研究者实现了哺乳动物全脑干尺度的高分辨三维成像，并结合FLIM技术解决了复杂生物样本中的信号串扰问题。这些进展不仅提升了逆行示踪实验的效率和精度，更为神经再生、疼痛环路解析及退行性疾病机制研究开辟了新路径。随着双光子显微系统的小型化与高通量化，此类技术有望从基础研究走向临床病理诊断，例如术中神经束定位或神经移植效果评估。
声明：本文仅用作学术目的。
Miller MQ, Hernández IC, Chacko JV, Minderler S, Jowett N. Two-photon excitation fluorescent spectral and decay properties of retrograde neuronal tracer Fluoro-Gold. Sci Rep. 2021 Sep 10;11(1):18053.
DOI:10.1038/s41598-021-97562-3.
本站“ABIO生物试剂品牌网”图片文字来自互联网
如果有侵权请联系微信: nanhu9181 处理，感谢~
