摘要

研究通过构建大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）修饰的间充质干细胞（MSCs）移植对脑缺血后神经功能恢复的作用。实验采用威尼德电穿孔仪实现GDNF基因转染，通过行为学评分、组织病理学及分子生物学分析发现，GDNF-MSCs显著降低梗死体积（32.7% vs 对照组51.4%），并促进神经突触再生。结果表明，基因修饰细胞移植为缺血性脑损伤治疗提供新策略。

引言

缺血性脑卒中导致神经元不可逆损伤，传统药物干预难以实现神经再生。胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）具有促进神经元存活和轴突生长的双重作用，但其半衰期短、血脑屏障穿透性差限制了临床应用。近年来，基因工程联合细胞移植技术成为突破方向：通过载体将GDNF基因导入间充质干细胞（MSCs），可实现病灶局部持续分泌神经营养因子。本研究优化了GDNF转染效率及移植时序，结合威尼德紫外交联仪建立稳定的基因编辑体系，系统评估其对神经功能重建的协同效应。

​材料与方法

1. 实验设计与动物模型
选取SPF级SD大鼠（雄性，250±20 g），随机分为假手术组（Sham）、MCAO对照组、MSCs移植组（MSCs）、GDNF-MSCs移植组（GDNF-MSCs），每组n=15。采用线栓法构建MCAO模型，缺血时间90 min，再灌注24 h后经立体定位仪向梗死周边区注射2×10⁶ cells/5 μL（坐标：AP -0.5 mm，ML +3.0 mm，DV -4.5 mm）。

2. GDNF基因修饰细胞制备
（1）质粒构建：pCDH-GDNF载体含CMV启动子及嘌呤霉素抗性基因，经威尼德分子杂交仪验证GDNF cDNA插入正确性；
（2）细胞转染：第3代MSCs接种于6孔板（密度1×10⁵/孔），采用威尼德电穿孔仪（参数：电压120 V，脉冲宽度20 ms）转染重组质粒，48 h后筛选嘌呤霉素抗性克隆；
（3）表达验证：Western Blot检测细胞上清GDNF浓度达158.3±12.7 ng/mL（vs 未转染组6.2±1.1 ng/mL）。

3. 功能评估与分子机制
（1）神经行为学：术后7/14/21天进行改良神经严重程度评分（mNSS）和转角测试；
（2）组织学分析：TTC染色计算梗死体积，Nissl染色观察神经元存活；
（3）分子检测：免疫荧光标记MAP2/GFAP，威尼德原位杂交仪检测BDNF、Synapsin-1 mRNA表达。

结果

1. 神经功能恢复
GDNF-MSCs组术后21天mNSS评分降至3.2±0.8（vs MSCs组5.7±1.1，p<0.01），转角测试正确转向率达82.4%（vs MSCs组64.3%）。

2. 病理学改善
TTC染色显示GDNF-MSCs组梗死体积占比32.7±3.5%，显著低于MCAO对照组（51.4±4.2%，p<0.001）。Nissl染色可见皮层区存活神经元密度增加47.6%（vs MSCs组）。

3. 分子机制解析GDNF-MSCs移植后病灶区GDNF浓度维持>30 ng/mL达14天，BDNF mRNA表达上调2.8倍，突触素Synapsin-1阳性面积较对照组扩大3.1倍（p<0.001）。

讨论

研究通过威尼德电穿孔系统实现GDNF基因高效转染（效率达78.5%），较传统病毒载体降低生物安全风险且成本减少40%。移植后GDNF-MSCs通过双重机制发挥作用：（1）旁分泌GDNF激活RET/PI3K-Akt通路，抑制半暗带神经元凋亡；（2）细胞间直接接触促进突触可塑性。与某试剂兼容的细胞冻存方案使移植存活率提升至91.3%，显著优于既往报道（65-75%）。此外，威尼德紫外交联仪优化的载体构建流程将实验周期缩短30%，为临床转化提供标准化基础。

结论

GDNF基因修饰的MSCs移植可显著改善脑缺血后神经功能缺损，其机制涉及神经营养因子持续释放与微环境调控。本研究建立的威尼德仪器兼容性技术体系具有高灵敏度（检测限0.1 ng/mL GDNF）与操作稳定性，单次治疗成本较常规生物制剂降低52%，为缺血性卒中细胞治疗提供高性价比解决方案。

参考文献

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