凝胶检测作为经典的细菌内毒素检测方法，自20世纪70年代起便在医药领域广泛应用。1980年，美国食品药品监督管理局（FDA）率先制定相关指导原则，随后美国药典（USP）也将其纳入标准，使其成为法定检测方法。

USP<85>明确规定：“当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度法结果为准”，确立了凝胶检测在细菌内毒素检测中的重要地位。
 

一、凝胶检测方法操作概述
在实际操作中，首先要制备内毒素标准系列，所需材料包括内毒素控制标准品（CSE）、无热原水（LRW）和LAL试剂。LAL试剂的灵敏度（λ）是关键参数，通常标注在分析证书（CoA）和试剂小瓶上。测试标准曲线的稀释倍数一般设为2λ、λ、0.5λ和0.25λ，且标准曲线只有在λ的2倍稀释范围内呈现阳性结果才有效。

具体测试时，将100µL的产品稀释液与100µL的LAL试剂等量混合。阳性产品对照需通过将产品稀释后接种至2λ内毒素水平来制备，同时要设置未接种稀释液（如LRW）作为阴性对照。

混合后的试管在37°C环境下孵育60分钟±2分钟。孵育结束后，轻轻取出试管并缓缓倒转180°，观察凝胶形成情况。若管内形成坚实凝胶，且不变形、不从管壁滑脱，则判定为阳性；反之则为阴性。整个保温及拿取试管过程需避免振动，防止因振动导致凝胶破坏，出现假阴性结果。

二、BET计算
1、内毒素限值（L）计算
内毒素限值（L）的计算是细菌内毒素检测的关键环节，其计算公式为：

其中，“K”表示人每千克体重或每平方米体表面积每小时最大可接受的内毒素剂量。不同类型注射剂的K值有所差异：

• 注射剂K=5EU/(kg·h)
• 放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg·h)
• 鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg·h)
• 按体表面积给药时K=100EU/(m²·h)​

“M”为人用每千克体重或每平方米体表面积每小时的最大供试品剂量，M值需结合最大给药剂量、人均体重（美国70kg，中国及日本60kg）及注射时间（不足1小时按1小时计）来确定。

2、最大有效稀释（MVD）计算

其中，L为内毒素限值，c为供试品溶液的浓度。

3、最小有效稀释浓度（MVC）计算

其中，L为内毒素限值，λ为灵敏度。

4、标准系列的稀释倍数计算

例如，重组CSE小瓶中含有50EU/mL，λ为0.125EU/mL。该计算方法通过已知内毒素浓度（50EU/mL）除以所需的内毒素值（20λ或2.5EU/mL）确定稀释倍数，即需进行1:20稀释以从重组CSE小瓶中获得20λ标准液。

该溶液既可用于阳性对照制备（取10μL20λCSE加入100μL产品稀释液形成2λ热加标，此加标样本应呈现阳性），也可进一步制备内毒素标准系列：从20λ稀释液进行1:10稀释得到2λ标准液，再通过1:2稀释构建完整标准系列。

三、方法开发注意事项
凝胶检测方法的开发需充分了解产品特性，包括溶解度、潜在干扰因素、内毒素限值、适用稀释度以及pH范围等，并与研发技术人员密切协作。

干扰筛查（抑制/增强）是方法开发的重要环节，通常通过MVD/MVC梯度稀释（如1:2系列）来实施。

针对干扰问题，常用的解决方法是稀释法。若稀释法无法完全消除干扰，可通过调整pH至6-8（利用缓冲液或专用试剂）或消除葡聚糖干扰等方式解决。

四、方法验证策略
验证批次要求在方法验证阶段，通常使用三批产品进行商业产品方法验证。对于临床产品，若配方尚未定型，可采用单批次三次重复验证的方式。

pH值控制验证过程中，必须确保鲎试剂（LAL）与产品稀释液混合后的pH值严格控制在6-8范围内。若在验证时需要调整pH值，后续常规检测也必须采用相同的调整操作。

标准系列构建与有效性判定验证时需同步构建产品标准系列和LRW内毒素标准系列。产品标准系列需在接种2λ内毒素后进行1:2梯度稀释，直至λ、0.5λ、0.25λ浓度，各浓度及阴性对照（NPC）均需进行四次重复；LRW内毒素标准系列则进行两次重复。有效性判定要求产品标准系列在2倍λ稀释范围内均呈阳性，以此确保标准系列的有效性和检测方法的可靠性。

若检测结果无效，需全面排查潜在因素，包括移液误差、操作失误、标准品效价不足、污染或稀释错误等，及时纠正问题，重新进行检测，直至获得可靠的检测结果。图1展示了产品标准系列和LRW标准系列的试管设置，为验证过程提供直观参考。