Pipetty电动移液器在猪蓝耳病毒检测（RT-PCR）中的应用_abio生物试剂品牌网
方案摘要：猪繁殖与呼吸综合征，是由病毒（PRRSV）感染猪引起的一种高度传染性疫病，临床表现为母猪繁殖系统障碍，断奶仔猪消瘦、生长迟缓以及死亡率增加。该病能引起猪体温升高、呼吸困难，导致猪耳朵发绀，又称蓝耳病，针对 PRRSV RT-PCR 检测中样本前处理易损失、反应体系配制易污染、批量操作效率低等问题，通过 PIpetty 电动移液器的高精度、防污染及自动化功能，实现 RNA 回收率提升、交叉污染降低、检测周期缩短，保障检测结果的准确性与可重复性。
方案详情：
一、实验原理
核心为 “逆转录 + PCR 扩增”：先以逆转录酶将病毒 RNA 转为 cDNA（解决 PCR 不能扩 RNA 的问题），再用 PRRSV 特异性引物和酶，通过循环让 cDNA 指数级复制，最后凭特异性荧光信号或 DNA 条带判断结果（有则阳性、无则阴性），整体具有高特异、高敏感的特点。
二、 实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头；
② PCR 仪；
③ 高速台式冷冻离心机（4℃，离心速度 12 000 r/min 以上）；
④ 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；
⑤ 凝胶成像系统；
⑥ 混匀器；
⑦ 冰箱（2℃~8℃、-20 ℃和-70 ℃）；
⑧ 组织研磨器。
2、试剂和材料
① PBS液；
② 商品化的 RNA 提取裂解液；
③ 三氯甲烷；
④ 异丙醇（-20℃预冷）；
⑤ DEPC 水；
⑥ 75%乙醇；
⑦ M-MLV 反转录酶（10 U/μL）；
⑧ 5XRT 缓冲液；
⑨ RNA 酶抑制剂（40 U/μL）；
⑩ Tag 酶（10 U/L）；
⑪ 10XPCR 缓冲液；
⑫ dNTPS（含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 10 mmol/L）；
⑬ 10xMgCl 2（ 25 mmol/L）；
⑭ 甘油或矿物油；
⑮ 引物；
⑯ 5×TBE 电泳缓冲液；
⑰ EB 溶液；
⑱ 电泳上样缓冲液：100 mL 溶液中含 0.25g溴酚蓝及 40g蔗糖。
三、实验步骤
1、样本总 RNA 的提取
a） 取灭菌的 1.5 mL离心管，基于样本数量进行编号。每管加入 600 μL 细胞裂解液，使用Pipetty电动移液器，设置连续分液功能，然后分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照、空白对照（无核酸酶水）各 200μL，每加一份样本换用一个吸头，再各加入 200 μL 三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5 s。于4 ℃经 12 000 r/min 离心 15 min。
b） 取相同数量灭菌的 1.5 mL离心管，加入 500μL异丙醇。吸取各管中的上清液（至少 500 μL）转移至相应的管中，并颠倒混匀。
c） 于4 ℃经 12 000 r/min 离心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上吸干液体，然后加入600 μL 75%乙醇进行洗涤。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上吸干液体。
e） 64 000 r/min 离心 10 s，将管壁上的残余液体甩至管底部，用微量移液器吸干液体，室温干燥3 min。
f） 使用Pipetty连续分液模式，加入 11 μL DEPC水，混匀模式，自动混匀，以溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心5s，置于冰上备用。提取的 RNA 应在 2h内进行 RT-PCR 扩增，否则应置于-70 ℃冰箱保存。
2、反转录（RT）
反应液总量 20 μL。依次在 RT 反应管中加入 RNA 模板和试剂：
b） 将表1中的试剂充分混匀，4 000 r/min 离心 30 s。PCR 的反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，35 个循环；72 ℃终延伸 10 min。扩增反应结束后，进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。
若采用一步法 RT-PCR，则省略反转录，用提取的 RNA 直接进行反应。一步法 RT-PCR 反应体系见表2。
一步法 RT-PCR 的反应条件：50 ℃反转录 30 min;94 ℃预变性5 min;94 ℃变性 30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸 50 s，35 个循环;72 ℃终延伸 10 min。
4、用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5%的琼脂糖（含 0.5 μg/mL EB）凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面，将6μL PCR 扩增产物和2μL电泳上样缓冲液混匀后加入样本孔。电泳时应设立 DNA Marker 对照。按5 V/cm 进行电泳 20 min~30min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。
四、结果判定
1、试验成立条件：PRRSV-1（欧洲型）阳性对照有大小为 398 bp的特异性扩增条带；PRRSV-2（美洲型）阳性对照有大小为 433 bp的特异性扩增条带;阴性对照和空白对照无任何扩增条带。
2、被检样本有大小为 398 bp的特异性扩增条带，且与阳性对照条带大小相符，则判为 PRRSV-1核酸阳性。
3、被检样本有大小为 433 bp的特异性扩增条带，且与阳性对照条带大小相符，则判为 PRRSV-2核酸阳性。
4、被检样本同时有大小为 398 bp和 433 bp的特异性扩增条带，且与阳性对照条带大小相符，则判为 PRRSV-1 和 PRRSV-2 核酸阳性。
5、被检样本无大小为 398 bp 或 433 bp 特异性的扩增条带，则样本判为 PRRSV 核酸阴性。必要时，可取 RT-PCR 扩增产物进行序列测定，并与已公开发表的 PRRSV 特异性片段序列进行同源性比对分析，以确证检测结果。
方案详情：
一、实验原理
核心为 “逆转录 + PCR 扩增”：先以逆转录酶将病毒 RNA 转为 cDNA（解决 PCR 不能扩 RNA 的问题），再用 PRRSV 特异性引物和酶，通过循环让 cDNA 指数级复制，最后凭特异性荧光信号或 DNA 条带判断结果（有则阳性、无则阴性），整体具有高特异、高敏感的特点。
二、 实验准备
1、设配和材料
① Pipetty电动移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸头；
② PCR 仪；
③ 高速台式冷冻离心机（4℃，离心速度 12 000 r/min 以上）；
④ 稳压稳流电泳仪和水平电泳槽；
⑤ 凝胶成像系统；
⑥ 混匀器；
⑦ 冰箱（2℃~8℃、-20 ℃和-70 ℃）；
⑧ 组织研磨器。
2、试剂和材料
① PBS液；
② 商品化的 RNA 提取裂解液；
③ 三氯甲烷；
④ 异丙醇（-20℃预冷）；
⑤ DEPC 水；
⑥ 75%乙醇；
⑦ M-MLV 反转录酶（10 U/μL）；
⑧ 5XRT 缓冲液；
⑨ RNA 酶抑制剂（40 U/μL）；
⑩ Tag 酶（10 U/L）；
⑪ 10XPCR 缓冲液；
⑫ dNTPS（含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各 10 mmol/L）；
⑬ 10xMgCl 2（ 25 mmol/L）；
⑭ 甘油或矿物油；
⑮ 引物；
⑯ 5×TBE 电泳缓冲液；
⑰ EB 溶液；
⑱ 电泳上样缓冲液：100 mL 溶液中含 0.25g溴酚蓝及 40g蔗糖。
三、实验步骤
1、样本总 RNA 的提取
a） 取灭菌的 1.5 mL离心管，基于样本数量进行编号。每管加入 600 μL 细胞裂解液，使用Pipetty电动移液器，设置连续分液功能，然后分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照、空白对照（无核酸酶水）各 200μL，每加一份样本换用一个吸头，再各加入 200 μL 三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀5 s。于4 ℃经 12 000 r/min 离心 15 min。
b） 取相同数量灭菌的 1.5 mL离心管，加入 500μL异丙醇。吸取各管中的上清液（至少 500 μL）转移至相应的管中，并颠倒混匀。
c） 于4 ℃经 12 000 r/min 离心 15 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上吸干液体，然后加入600 μL 75%乙醇进行洗涤。
d） 于4 ℃、12 000 r/min 离心 10 min，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上吸干液体。
e） 64 000 r/min 离心 10 s，将管壁上的残余液体甩至管底部，用微量移液器吸干液体，室温干燥3 min。
f） 使用Pipetty连续分液模式，加入 11 μL DEPC水，混匀模式，自动混匀，以溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心5s，置于冰上备用。提取的 RNA 应在 2h内进行 RT-PCR 扩增，否则应置于-70 ℃冰箱保存。
2、反转录（RT）
反应液总量 20 μL。依次在 RT 反应管中加入 RNA 模板和试剂：
- RNA 模板：提取样本的总 RNA 5 μL
- 下游引物 P2 1 μL
- 5XRT缓冲液 4 μL
- 10 mmol/l dNTPs 2 μL
- RNA 酶抑制剂 1 μL
- M-MLV 反转录酶 1 μL
- DEPC水 6 μL
- PCR扩增，
- PCR反应体系见表1。
b） 将表1中的试剂充分混匀，4 000 r/min 离心 30 s。PCR 的反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，35 个循环；72 ℃终延伸 10 min。扩增反应结束后，进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。
若采用一步法 RT-PCR，则省略反转录，用提取的 RNA 直接进行反应。一步法 RT-PCR 反应体系见表2。
一步法 RT-PCR 的反应条件：50 ℃反转录 30 min;94 ℃预变性5 min;94 ℃变性 30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸 50 s，35 个循环;72 ℃终延伸 10 min。
4、用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5%的琼脂糖（含 0.5 μg/mL EB）凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面，将6μL PCR 扩增产物和2μL电泳上样缓冲液混匀后加入样本孔。电泳时应设立 DNA Marker 对照。按5 V/cm 进行电泳 20 min~30min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。
四、结果判定
1、试验成立条件：PRRSV-1（欧洲型）阳性对照有大小为 398 bp的特异性扩增条带；PRRSV-2（美洲型）阳性对照有大小为 433 bp的特异性扩增条带;阴性对照和空白对照无任何扩增条带。
2、被检样本有大小为 398 bp的特异性扩增条带，且与阳性对照条带大小相符，则判为 PRRSV-1核酸阳性。
3、被检样本有大小为 433 bp的特异性扩增条带，且与阳性对照条带大小相符，则判为 PRRSV-2核酸阳性。
4、被检样本同时有大小为 398 bp和 433 bp的特异性扩增条带，且与阳性对照条带大小相符，则判为 PRRSV-1 和 PRRSV-2 核酸阳性。
5、被检样本无大小为 398 bp 或 433 bp 特异性的扩增条带，则样本判为 PRRSV 核酸阴性。必要时，可取 RT-PCR 扩增产物进行序列测定，并与已公开发表的 PRRSV 特异性片段序列进行同源性比对分析，以确证检测结果。
