揭秘双抗细胞株构建的理论与实践_abio生物试剂品牌网
1. 双特异性抗体的优势与挑战
随着蛋白质工程技术的不断进步，双/多特异性结构类型也越发多样：重链和轻链以不同数量和不同形式组合形成各式各样的分子结构。一般来说，双特异性抗体根据是否包含可结晶片段（Fc）进行分类，药代动力学、半衰期、Fc受体介导功能（如适用）和生物学活性等也会因分子结构而有显著差异。
我们还可将不同抗原结合位点（如scFv或Fab）与其他蛋白结构域融合产生双特异性抗体，从而进一步功能化。如今，临床试验中大多数候选药物都是BiTE、DART、二聚体“杵臼结构”("knob-in-hole")抗体。
图一 不同类型的双抗结构图
由于双抗或者多抗有着两个或多个位点与靶细胞交互作用，可实现更多靶向结合，并通过重定向具有细胞毒性的免疫效应细胞来激活更多免疫反应，例如T细胞和自然杀伤（Natural Killer）细胞的双重定向可以产生更显著的靶向细胞毒性效应。另外，双特异性抗体在多结合位点和不同通路的参与之下，还可以降低出现耐药性的几率。
然而，双抗在生产工艺当中依然面临诸多挑战。
由于双抗的结构种类繁多，轻重链组合数非常多，需要在质粒构建就给出适合的解决方案。默克的CHOZN® GS和UCOE® 组合成熟，应用的双抗成功案例非常多，可以大大提高前期摸索试验的效率（数据见后文）。
双抗结构类型的复杂性意味着会对蛋白表达和制造工艺带来诸多挑战，包括表达量低、杂质高、产品质量不稳定和蛋白质聚集等。本文结合两篇文章重点探讨的就是如何借助新技术来解决双抗分子细胞株开发中的难题。
2. 首先通过两篇文献来介绍如何通过链间平衡优化双抗的产量以及纯度
对于共轻链的双抗可以采取单载体或者双载体的系统进行表达，如图二所示，采用HCF-LC-HC的顺序进行质粒构建，获得的minipool产量和纯度，分别只有200-400mg/L，33%的异源二聚体比例。
图二 双抗的质粒结构和表现
经过将三条链的顺序进行调整，对比各链间组合的双抗表达量与异源二聚体的纯度，如图三可以看出，HCF-HC-LC-LC的表现最好，minipool的产量达到912mg/L，POI（Protein of Interest）纯度达到93%。因此，在对双抗分子进行细胞株开发的前，质粒载体的构建优化是十分必要的。
图三 不同质粒配对的蛋白表达和纯度
对于一些十分难表达的分子，微小RNA（miRNA）的应用可以提高外源基因的表达。对于提高双抗的表达有很大的帮助。它的原理主要涉及其在基因调控中的作用：
1） 靶向抑制因子；
2） 调节转录因子；
3） 增强mRNA的稳定性；
4） 调节细胞信号通路，改善细胞生长特性；
5）调节翻译因子。
根据研究，将CHO细胞进行细胞工程改造，过表达miRNA-557，可显著提高抗体表达量。多个分子在CHO细胞中瞬转的结果，如图四显示，miR-557都能提高抗体的表达40%以上。
图四 瞬时转染miRNA对抗体表达的影响
在获得瞬转的结果，文章继续探讨稳定转染后单克隆的表现，如图五显示，top克隆在表达量方面显著提高，同时，细胞生长与代谢方面也具备一定优势。
图五 稳定转染miRNA对难表达分子和细胞生长的影响
3. CHOZN® +UCOE® 平台表达双抗分子
图六 UCOE®质粒结构
如上图所示，默克UCOE®质粒的元件介绍，可以同时表达双表达框的质粒，UCOE®序列作为持家基因的保守序列，可以显著降低插入位点的甲基化水平，从而提高插入到任意位点的外源基因的表达。
我们在设计双抗BCMA/CD3的四条链的质粒时，将其定为双质粒表达，分别是UCOE-LC1-HC1和UCOE-LC2-HC2，两个质粒载体转染比例为1：1。
质粒转染后按照5000cell/well进行minipool铺板8块96孔板，并进行titer筛选，96孔板的表达如下图所示：有效minipool有600个，top表达水平45mg/L左右。
图七 96孔板阶段minipool表达量
经过minipool的扩培，Top20 minipool的fedbatch结果如图八所示，经过对minipool的产量与双抗纯度的研究，选取2个高表达与高纯度的minipool进行单克隆的筛选，最终一共铺板16块，克隆形成率22%，通过单克隆成像，分析有效克隆将近500个。96孔板的数据如图九所示。
图八 Top20 minipool摇管Fedbatch的表达结果
图九 单克隆在96孔板的表达结果
经过克隆的扩培，进行Top30进行Fedbatch，如图八所示，top克隆表达量3g/L，并最终进行了异源二聚体的比例分析，采用去糖分子量的质谱方法，纯度最高为85%。
图十 Top30单克隆在摇管中的Fedbatch结果
注：红色柱代表克隆来源于Minipool1，蓝色柱来源于minipool2。Fedbatch培养基均为：EX-CELL® Advanced CHO Fed-batch培养基和Cellvento® ModiFeed Prime COMP。
以上是我们初步的双抗测试结果，CHOZN® GS &UCOE® 平台十分成熟，在低通量的筛选后，获得较为突出的单克隆，在不经过任何工艺优化的前提下，获得表达量3g/L，单体比例85%的双抗单克隆。
4. 总结
综上所述，双抗的开发工艺十分复杂，可以更多的从分子设计，载体构建等方面进行链间表达平衡的优化。那么，将复杂问题简单化，默克的CHOZN® GS + UCOE® 平台可以作为优质的解决方案，提供完备的protocol与成熟的团队支持。除此之外，CHOZN® GS & UCOE® 平台在国内外市场，对于单抗、融合蛋白以及双抗等各种分子都有丰富的实际案例，双抗经过高通量筛选，工艺优化后最高的实际案例能达到10g/L以上。
Reference：
Zhang, S., et al. (2015). Biotechnology Progress 31(4): 1077-1085.
Simon Fischer et.al. miRNA Engineering of CHO Cells Facilitates Production of Difficult-to-Express Proteins and Increases Success in Cell Line Development
Barbara Tevelev. Et. Al. Genetic rearrangement during site specific integration event facilitates cell line development of a bispecific molecule
[1] Labrijn, Aran F. , Maarten L. Janmaat,Janice M. Reichert and Paul W. H. I. Paren. Bispecific antibodies: amechanistic review of the PIpeline. NatureReviews Drug Discovery. 18: 585–608 (2019).
[2] Global Bispecific Antibody Market to 2025:Drug Sales & Clinical Pipeline Insights with an $8 Billion MarketOpportunity. Research and Markets. 18 Jan. 2019. Web.
[3] Bispecific Antibodies Market - GlobalIndustry Insights, Trends, Outlook, and Opportunity Analysis, 2018-2026. Rep.Coherent Market Insights. Oct. 2019. Web.
[4] Bispecific Antibodies Market By Type(Immunoglobulin G (IgG) Like Molecule, Non Immunoglobulin G (IgG) LikeMolecule), by Application (Oncology, Autoimmune Disease, Others) - Growth,Future Prospects & Competitive Analysis, 2018 – 2026. Rep. CredenceResearch. Dec. 2018. Web.
随着蛋白质工程技术的不断进步，双/多特异性结构类型也越发多样：重链和轻链以不同数量和不同形式组合形成各式各样的分子结构。一般来说，双特异性抗体根据是否包含可结晶片段（Fc）进行分类，药代动力学、半衰期、Fc受体介导功能（如适用）和生物学活性等也会因分子结构而有显著差异。
我们还可将不同抗原结合位点（如scFv或Fab）与其他蛋白结构域融合产生双特异性抗体，从而进一步功能化。如今，临床试验中大多数候选药物都是BiTE、DART、二聚体“杵臼结构”("knob-in-hole")抗体。
图一 不同类型的双抗结构图
由于双抗或者多抗有着两个或多个位点与靶细胞交互作用，可实现更多靶向结合，并通过重定向具有细胞毒性的免疫效应细胞来激活更多免疫反应，例如T细胞和自然杀伤（Natural Killer）细胞的双重定向可以产生更显著的靶向细胞毒性效应。另外，双特异性抗体在多结合位点和不同通路的参与之下，还可以降低出现耐药性的几率。
然而，双抗在生产工艺当中依然面临诸多挑战。
由于双抗的结构种类繁多，轻重链组合数非常多，需要在质粒构建就给出适合的解决方案。默克的CHOZN® GS和UCOE® 组合成熟，应用的双抗成功案例非常多，可以大大提高前期摸索试验的效率（数据见后文）。
双抗结构类型的复杂性意味着会对蛋白表达和制造工艺带来诸多挑战，包括表达量低、杂质高、产品质量不稳定和蛋白质聚集等。本文结合两篇文章重点探讨的就是如何借助新技术来解决双抗分子细胞株开发中的难题。
2. 首先通过两篇文献来介绍如何通过链间平衡优化双抗的产量以及纯度
对于共轻链的双抗可以采取单载体或者双载体的系统进行表达，如图二所示，采用HCF-LC-HC的顺序进行质粒构建，获得的minipool产量和纯度，分别只有200-400mg/L，33%的异源二聚体比例。
图二 双抗的质粒结构和表现
经过将三条链的顺序进行调整，对比各链间组合的双抗表达量与异源二聚体的纯度，如图三可以看出，HCF-HC-LC-LC的表现最好，minipool的产量达到912mg/L，POI（Protein of Interest）纯度达到93%。因此，在对双抗分子进行细胞株开发的前，质粒载体的构建优化是十分必要的。
图三 不同质粒配对的蛋白表达和纯度
对于一些十分难表达的分子，微小RNA（miRNA）的应用可以提高外源基因的表达。对于提高双抗的表达有很大的帮助。它的原理主要涉及其在基因调控中的作用：
1） 靶向抑制因子；
2） 调节转录因子；
3） 增强mRNA的稳定性；
4） 调节细胞信号通路，改善细胞生长特性；
5）调节翻译因子。
根据研究，将CHO细胞进行细胞工程改造，过表达miRNA-557，可显著提高抗体表达量。多个分子在CHO细胞中瞬转的结果，如图四显示，miR-557都能提高抗体的表达40%以上。
图四 瞬时转染miRNA对抗体表达的影响
在获得瞬转的结果，文章继续探讨稳定转染后单克隆的表现，如图五显示，top克隆在表达量方面显著提高，同时，细胞生长与代谢方面也具备一定优势。
图五 稳定转染miRNA对难表达分子和细胞生长的影响
3. CHOZN® +UCOE® 平台表达双抗分子
图六 UCOE®质粒结构
如上图所示，默克UCOE®质粒的元件介绍，可以同时表达双表达框的质粒，UCOE®序列作为持家基因的保守序列，可以显著降低插入位点的甲基化水平，从而提高插入到任意位点的外源基因的表达。
我们在设计双抗BCMA/CD3的四条链的质粒时，将其定为双质粒表达，分别是UCOE-LC1-HC1和UCOE-LC2-HC2，两个质粒载体转染比例为1：1。
质粒转染后按照5000cell/well进行minipool铺板8块96孔板，并进行titer筛选，96孔板的表达如下图所示：有效minipool有600个，top表达水平45mg/L左右。
图七 96孔板阶段minipool表达量
经过minipool的扩培，Top20 minipool的fedbatch结果如图八所示，经过对minipool的产量与双抗纯度的研究，选取2个高表达与高纯度的minipool进行单克隆的筛选，最终一共铺板16块，克隆形成率22%，通过单克隆成像，分析有效克隆将近500个。96孔板的数据如图九所示。
图八 Top20 minipool摇管Fedbatch的表达结果
图九 单克隆在96孔板的表达结果
经过克隆的扩培，进行Top30进行Fedbatch，如图八所示，top克隆表达量3g/L，并最终进行了异源二聚体的比例分析，采用去糖分子量的质谱方法，纯度最高为85%。
图十 Top30单克隆在摇管中的Fedbatch结果
注：红色柱代表克隆来源于Minipool1，蓝色柱来源于minipool2。Fedbatch培养基均为：EX-CELL® Advanced CHO Fed-batch培养基和Cellvento® ModiFeed Prime COMP。
以上是我们初步的双抗测试结果，CHOZN® GS &UCOE® 平台十分成熟，在低通量的筛选后，获得较为突出的单克隆，在不经过任何工艺优化的前提下，获得表达量3g/L，单体比例85%的双抗单克隆。
4. 总结
综上所述，双抗的开发工艺十分复杂，可以更多的从分子设计，载体构建等方面进行链间表达平衡的优化。那么，将复杂问题简单化，默克的CHOZN® GS + UCOE® 平台可以作为优质的解决方案，提供完备的protocol与成熟的团队支持。除此之外，CHOZN® GS & UCOE® 平台在国内外市场，对于单抗、融合蛋白以及双抗等各种分子都有丰富的实际案例，双抗经过高通量筛选，工艺优化后最高的实际案例能达到10g/L以上。
Reference：
Zhang, S., et al. (2015). Biotechnology Progress 31(4): 1077-1085.
Simon Fischer et.al. miRNA Engineering of CHO Cells Facilitates Production of Difficult-to-Express Proteins and Increases Success in Cell Line Development
Barbara Tevelev. Et. Al. Genetic rearrangement during site specific integration event facilitates cell line development of a bispecific molecule
[1] Labrijn, Aran F. , Maarten L. Janmaat,Janice M. Reichert and Paul W. H. I. Paren. Bispecific antibodies: amechanistic review of the PIpeline. NatureReviews Drug Discovery. 18: 585–608 (2019).
[2] Global Bispecific Antibody Market to 2025:Drug Sales & Clinical Pipeline Insights with an $8 Billion MarketOpportunity. Research and Markets. 18 Jan. 2019. Web.
[3] Bispecific Antibodies Market - GlobalIndustry Insights, Trends, Outlook, and Opportunity Analysis, 2018-2026. Rep.Coherent Market Insights. Oct. 2019. Web.
[4] Bispecific Antibodies Market By Type(Immunoglobulin G (IgG) Like Molecule, Non Immunoglobulin G (IgG) LikeMolecule), by Application (Oncology, Autoimmune Disease, Others) - Growth,Future Prospects & Competitive Analysis, 2018 – 2026. Rep. CredenceResearch. Dec. 2018. Web.
