文章标题：Endoplasmic reticulum stress regulates swAInsonine-induced the autophagy in renal tubular ePIthelial cells through UPR signaling pathway
发表期刊：Science of the Total Environment，IF 8.0
合作客户：西北农林科技大学路浩团队
维真助力：自噬双标腺病毒
感染细胞：原代大鼠肾小管上皮细胞（RTECs）
病毒产品：Ad-mcherry-GFP-LC3
MOI：30
感染时间：4h Ad-mcherry-GFP-LC3检测RTECs自噬通量荧光图 研究背景
疯草（Locoweed）是一种有毒植物，苦马豆素（SW）是疯草的主要毒性成分，可诱导放牧牲畜产生毒性反应。苦马豆素诱导的毒性症状包括头部震颤、共济失调和肢体瘫痪，毒性机制仍有待研究。未折叠蛋白反应（UPR）通过减少蛋白质合成和促进错误折叠蛋白质的降解，在缓解内质网应激（ERS）中起着关键作用。ERS与UPR和自噬激活密切相关，然而，UPR信号通路在SW诱导的ERS和自噬中的作用尚不清楚。 研究结果
1、SW诱导RTECs的ERS和UPR
作者研究发现SW诱导小鼠肾脏中的ERS、UPR和自噬，并可能通过触发ERS、UPR和自噬共同导致肾脏损伤。进一步分离大鼠原代RTECs，并用递增浓度的SW处理12h，发现细胞内空泡形成呈剂量依赖性增加，并且空泡数量呈时间依赖式增加。为了研究SW对ERS和UPR的影响，RTECs用SW处理12小时。WB分析显示，与对照组相比，XBP1s、CHOP、GRP78、ATF6、p-IRE1α/IRE1α、p-eIF2α/eIF2α和p-PERK/PERK的蛋白表达水平以剂量依赖的方式显著增加。同样，Xbp1s、Chop、Ggp78、Atf6、Ire1α、Eif2α和Perk的mRNA水平也显示出显著的剂量依赖性增加。免疫荧光分析表明，绿色荧光强度随着SW浓度的升高而逐渐增加，表明GRP78、XBP1s和ATF4蛋白的表达上调。这些发现表明，SW诱导RTEC中ERS和UPR的激活。进一步研究发现SW以时间依赖的方式诱导ERS并激活UPR。
图1. SW诱导大鼠原代RTECs的ERS和UPR 2、SW在原代大鼠RTECs中诱导自噬同时损害其进展
由于细胞空泡化与自噬有关，作者研究了SW对自噬的影响。结果表明，自噬相关蛋白LC3-II、p62和ATG5的相对表达水平以SW剂量依赖和时间依赖的方式增加。Ad-GFP-mCherry-LC3自噬双荧光标记显示，绿色和红色荧光的强度随着SW剂量的增加和持续时间的延长而增加。此外，黄色荧光（表示融合荧光）的强度也随着剂量和时间的增加而增加，表明SW会损害自噬通量，表明SW在RTEC中诱导自噬，同时阻断自噬通量。作者进一步研究PERK、IRE1α和ATF6 三种UPR信号通路对自噬的调节作用，发现：PERK通路通过调节自噬相关基因的表达和增强自噬降解来调节SW诱导的自噬；IRE1α通路可能通过JNK和XBP1信号通路调节SW诱导的自噬；ATF6可能通过直接调节自噬相关基因的表达来调节SW诱导的自噬。 图2. SW诱导原代大鼠RTEC的自噬 小结
本研究首次阐明了SW在RTECs中诱导的ERS激活UPR，并且阐明了ERS介导的UPR通路调节SW诱导的自噬的分子机制。在RTECs细胞培养模型中，PERK和ATF6主要通过调节自噬相关基因的表达来调节自噬；同时IRE1α可能通过两种不同的机制调节自噬：通过IRE1α-XBP1通路调节自噬相关基因的表达，以及通过IRE1β-JNK信号通路直接调节自噬过程。本研究结果不仅加深了对SW毒理学机制的理解，也为预防和控制疯草中毒提供了理论依据。