PIvotal role of IL-8 derived from the interaction between osteosarcoma and tumor-associated macrophages in osteosarcoma growth and metastasis via the FAK pathway

Subject terms: Bone cancer, Cancer microenvironment

骨肉瘤（OS）是困扰儿童和青少年最普遍的原发性骨肿瘤。在肉瘤中，与肿瘤类似，肿瘤微环境（TME），包括细胞外基质、血小板、成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓来源的炎症细胞和信号分子等成分，已经引起了人们的关注。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是 TME 的主要成分，大致可分为 M1 和 M2表型，前者具有促炎、肿瘤抑制作用，后者具有抗炎、肿瘤支持作用。此外，包括肉瘤在内的各种 TAM 表型已被记录，强调了它们在各种过程中的多方面作用，包括肿瘤生长、转移促进和血管生成。TAM 衍生的细胞因子在这些过程中起着核心作用。尽管研究已报道了 IL-6 在未分化多形性肉瘤（UPS）中的重要性，但 OS 中的关键细胞因子仍未得到充分了解。

IL-8 在炎症组织中诱导中性粒细胞的趋化性，并促进肿瘤细胞的增殖和血管生成。IL-8 在癌症中是一种转移性和预后因子，在 OS 中可能具有类似的体外和体内效应。然而，控制 TME 中 IL-8 产生的机制及其对 OS 的影响仍不清楚。

因此，日本山梨大学骨外科、熊本大学医学研究生院细胞病理学系、日本国立癌症研究中心等课题团队在一项联合研究中旨在全面阐明源自 OS 和 TAMs 之间相互作用中的 IL-8 的效应及其对 OS 生长和转移的影响。研究成果发表于 Cell Death & Disease 期刊题为“Pivotal role of IL-8 derived from the interaction between osteosarcoma and tumor-associated macrophages in osteosarcoma growth and metastasis via the FAK pathway”。
首先，使用免疫组织化学（IHC）比较原发性OS 患者和 OS 肺转移性患者部位的 TAM 数量，阐明巨噬细胞在 OS 中的作用。肺转移中巨噬细胞标志物 Iba1 和 M2 巨噬细胞/促肿瘤标志物 CD163 阳性细胞的数量和大小明显高于原发肿瘤。这些细胞频繁且高度共表达这两种标志物，表明 TAMs 可能支持 OS 进展。

然后，将 OS细胞和巨噬细胞共培养以模拟 TME（图1 D）。WST、划痕和侵袭试验结果显示，源自 OS 和 THP-1 来源的巨噬细胞的共培养条件培养基（CM）促进了 OS 细胞增殖、迁移和侵袭（图1 B-D），强调了 OS 细胞和巨噬细胞共培养产生的细胞因子对 OS 的促进作用。

图1 共培养 CM 对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
（A）将单核细胞分化为巨噬细胞并将其与 OS 细胞共培养。（B）使用 Cell Counting Kit-8 检测对经或不经共培养 CM 处理的 OS 细胞的细胞活力。（C、D）用或不用共培养 CM 处理的 OS 细胞的划痕和侵袭测定。

接下来，使用细胞因子阵列监测细胞因子谱，研究了源自 OS 和巨噬细胞共培养 CM 促进作用的确切机制，并观察到了几种细胞因子（包括 CXCL5 和 MCP-1）的改变。值得注意的是，共培养 CM 中的 IL-8 水平显著高于单独 OS 和巨噬细胞培养物上清液中的水平（图2 A）。

进一步研究人骨肉瘤细胞系 143B-Luc 或 SJSA-1 细胞与巨噬细胞共培养中 IL-8 的产生，发现当 OS 细胞与人或 THP-1 衍生的巨噬细胞共培养时，IL-8 的产生增加（图2 B）。此外，将 OS-CM 添加到 THP-1 衍生的或人巨噬细胞中时增加了 IL-8 基因和蛋白质表达（图2 C）。值得注意的是，OS 细胞本身也产生 IL-8，并且当巨噬细胞 CM 被引入 OS 细胞时，它同样增加了 IL-8 基因和蛋白质表达，反映了巨噬细胞中添加 OS-CM 的效果（图2 D）。此外，OS 患者的单细胞 RNA-seq 分析显示，Iba1+ CD163+ TAMs 中的 IL-8 表达高于 Iba-1− CD163− TAMs（图2 E-G）。这些结果表明，在 OS TME 中，TAMs 与 OS 相互作用以增强 IL-8 的产生。

为了阐明共培养 CM 中 IL-8 对 OS 细胞增殖、迁移和侵袭的影响，研究证实了 OS 细胞表达 CXCR1 和 CXCR2，它们是 IL-8 受体。此外，重组 IL-8 在促进两种 OS 细胞类型的增殖、迁移和侵袭方面表现出相似的趋势。使用抗-IL-8 抗体抑制共培养 CM 中的 IL-8 减弱了共培养 CM 促进的增殖、迁移和侵袭。因此，共培养 CM 中的 IL-8 在增强 OS 细胞增殖、迁移和侵袭中发挥作用。

鉴于 IL-8-FAK（粘着斑激酶）通路在癌症中的重要性，研究人员假设该通路可能对 OS 增殖、迁移和侵袭产生类似的影响。同样，在暴露于重组 IL-8 后，两种 OS 细胞类型中观察到 FAK 磷酸化。在共培养 CM 中加入抗-IL-8 抗体可显著抑制 FAK 磷酸化。此外，使用 FAK 磷酸化抑制剂也减弱了共培养 CM 的促进作用。这些研究结果表明，共培养 CM 中的 IL-8 通过 FAK 通路增强了 OS 细胞增殖、迁移和侵袭。

图2 骨肉瘤和巨噬细胞之间的相互作用增加了 IL-8 的产生。
（A）143B-Luc 细胞、人巨噬细胞和共培养 CM 的细胞因子阵列。（B）OS 细胞（143B-Luc、SJSA-1）和巨噬细胞（THP-1 Mφ、HMDMs）共培养过程中 IL-8 的产生。（C）IL-8 在用 OS-CM 刺激的巨噬细胞中的表达。（D）用巨噬细胞 CM 刺激的 OS 细胞中 IL-8 的表达。（E）OS 肺转移的 UMAP 图。（F）髓系细胞簇中 Iba1、CD163 和 IL-8 表达的 UMAP 图。（G）Violin 图描绘了 IL-8 在 Iba1+/- 或 CD163+/- 髓系细胞簇中的表达。

最后，通过裸鼠皮下移植OS细胞和每周3次向肿瘤旁注射共培养CM来研究IL-8在共培养CM中对原发部位的影响。在共培养 CM 组中，143B-Luc 和 SJSA-1 细胞显著增加了肿瘤体积和重量。IHC 分析显示，共培养 CM 组的 Ki-67 指数和磷酸化-FAK 水平高于对照组。

将抗-IL-8 抗体引入同一皮下异种移植肿瘤模型的共培养 CM 中，与对照组相比，抗-IL-8 抗体组中 143B-Luc 和 SJSA-1 细胞的肿瘤体积和重量均受到抑制。值得注意的是，抗- IL-8 抗体不会诱导小鼠体重减轻，但 Ki-67 指数和磷酸化-FAK 水平降低。

肺转移是影响骨肉瘤患者预后的关键因素，因此，通过用共培养 CM 预处理 OS 细胞并将其静脉注射到小鼠尾部，进一步研究其对肺转移的影响（图3 A）。14 天后，共培养 CM 组的 IVIS、肺集落计数和 Ki-67 指数均高于对照组（图3 B-D）。通过在共培养 CM 中加入抗-IL-8 抗体可减轻共培养 CM 的转移促进作用（图3 E-H），表明共培养 CM 中的 IL-8 可促进体内增殖和转移，从而突出了 IL-8 作为新治疗靶点的潜力。

图3 共培养 CM 中 IL-8 对肺转移的影响。
（A）OS 尾静脉注射的实验设计。（B）注射经或不经共培养CM预处理的肿瘤后14天肺转移的IVIS成像和定量。（C）肺切片的苏木精和伊红染色，有或没有共培养 CM 和肺集落的定量。（D）有或没有共培养 CM 的肺集落中 Ki-67 阳性细胞的免疫组织化学和 Ki-67 标记指数的定量。（E）使用抗-IL-8 抗体进行 OS 尾静脉注射的实验设计。（F）注射经共培养CM预处理的肿瘤后14天（含或不含IL-8抗体）肺转移的IVIS成像和定量。（G）加或不加IL-8抗体的共培养CM肺切片苏木精和伊红染色及肺菌落定量。（H）联合或不联合IL-8抗体共培养CM肺集落Ki-67阳性细胞的免疫组化及Ki-67标记指数的定量。

总之，该研究确定了 IL-8 是由 OS 和 TAMs 之间的相互作用产生的 TME 内的细胞因子，并进一步证实了它在体外、体内和患者样本中的重要性。研究结果还强调了 IL-8-FAK 轴是 IL-8 影响 OS 细胞的关键通路。考虑到肿瘤化疗的发展，IL-8 成为一种有前途的新型治疗靶点。

参考文献：Tatsuno R, Ichikawa J, Komohara Y, Pan C, Kawasaki T, Enomoto A, Aoki K, Hayakawa K, Iwata S, Jubashi T, Haro H. Pivotal role of IL-8 derived from the interaction between osteosarcoma and tumor-associated macrophages in osteosarcoma growth and metastasis via the FAK pathway. Cell Death Dis. 2024 Feb 1;15(2):108. doi: 10.1038/s41419-024-06487-y. Erratum in: Cell Death Dis. 2024 Jul 2;15(7):471. doi: 10.1038/s41419-024-06795-3. PMID: 38302407; PMCID: PMC10834992.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38302407/

Journal Impact Factor: 8.1

The ISSN (online) 2041-4889.

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