PCR扩增目的基因，胶图总是一片空白？反复摸索退火温度，胶图全是杂带？同学，你需要换一对引物了，一份包教包会的克隆引物设计指南送给你。

引物设计的一般原则
设计引物需要遵循的原则较多，如引物要有特异性，GC含量在40%-60%之间，Tm值在55-65℃，一对引物Tm值与GC含量不能相差太多，长度在16~30 bp为宜，避免一对引物发生互补，3′端不能选择A，碱基要随机分布等。

基因克隆引物通常由酶切识别序列和与靶基因互补配对的特异性序列两部分组成，特异性序列的靶点在基因CDS序列的两端，是相对固定的。因此克隆引物中的可变序列较少，需在尽量不改变特异性序列的条件下，通过修改酶切识别序列优化引物对。

两步学会设计克隆引物
1.明确载体多克隆位点处限制酶的种类，并下载目的基因CDS序列。
基因克隆中使用引物一是为了将基因CDS序列从cDNA中大量扩增，便于后续胶回收利用，二是通过酶切将基因连入载体中用于后续实验。因此需在CDS序列中筛选多克隆位点处所有限制酶的识别序列，选择载体多克隆位点的限制酶时，应避开在CDS内部存在识别序列的限制酶，否则会导致CDS序列被酶切，进而连入载体的序列不完整。

若CDS序列内含有多克隆位点处所有限制酶识别序列，则考虑更换载体，若无法更换载体则可通过优化不完全酶切时间，获得酶切的CDS全长序列，或采用无缝克隆试剂盒，跳过酶切步骤。

2. 通过修改酶切识别序列优化引物对。
将所有可用的酶切识别序列分别连接至引物对5’端，可获得多对引物，利用生信软件分析不同引物对的GC含量，TM值，序列特异性等信息，获得评分较高的引物对用于后续实验。

若评分较高的引物对还是存在GC含量、TM值相差过大，特异性不好等问题，可以通过在酶切识别序列两端添加1-3bp保护序列，逐步调整和优化引物对。