一、犬松弛素（CHW）概述

犬松弛素（Canine Relaxin，CHW）是由犬卵巢、胎盘等组织分泌的肽类激素，属于胰岛素超家族。其主要功能包括：

• 妊娠期松弛骨盆韧带、软化子宫颈，促进分娩；
• 参与心血管调节、乳腺发育及组织修复等生理过程。
  制备 CHW 单克隆抗体对犬繁殖疾病诊断（如早产、流产检测）、生殖内分泌研究及相关药物开发具有重要意义。

二、CHW 单克隆抗体制备流程
（一）抗原制备与优化

1. CHW 蛋白获取

   • 天然提取：从妊娠犬胎盘或卵巢组织中通过匀浆、离心提取粗蛋白，再经层析（亲和层析 / 离子交换层析）纯化，但天然蛋白产量低、纯度难以保证。
   • 重组表达： 
     • 克隆犬松弛素基因（含 A 链和 B 链编码区），构建至原核表达载体（如 pET 系统）或真核载体（如 CHO 细胞）；
     • 诱导表达后，通过镍柱亲和层析纯化重组蛋白，SDS-PAGE 和 Western blot 验证纯度（≥95%），并复性处理以确保抗原构象正确。

2. 抗原修饰与佐剂结合

   • 由于 CHW 分子量小（约 6 kDa），需与载体蛋白（如 KLH、BSA）偶联以增强免疫原性；
   • 与弗氏完全佐剂（初次免疫）或不完全佐剂（加强免疫）按 1:1 体积比乳化，制备免疫抗原。

（二）动物免疫方案

1. 实验动物选择
   6-8 周龄 SPF 级 Balb/c 小鼠（n=3-5），免疫前检测血清背景抗体（避免非特异性反应）。

2. 免疫程序

   • 初次免疫：背部皮下多点注射偶联抗原（50-100 μg / 只）+ 弗氏完全佐剂；
   • 加强免疫：每 2-3 周注射一次，共 3-4 次，使用弗氏不完全佐剂，剂量同初次；
   • 末次免疫：融合前 3 天，腹腔注射无佐剂抗原（50 μg / 只），刺激 B 细胞活化。

3. 免疫效果监测
   末次免疫后 7 天，采集小鼠血清，用 ELISA 法检测抗 CHW 抗体效价，选择效价≥1:10,000 的小鼠进行脾细胞提取。

（三）杂交瘤细胞制备与筛选

1. 脾细胞与骨髓瘤细胞融合

   • 取免疫小鼠脾脏，制备单细胞悬液（约 1×10^8 个细胞），与对数生长期的 SP2/0 骨髓瘤细胞（脾细胞：骨髓瘤细胞 = 5:1）在 50% PEG（分子量 1500）作用下，37℃融合 1.5 分钟，随后用 HAT 培养基终止反应。

2. HAT 培养基筛选
   接种融合细胞于 96 孔板（2×10^5 细胞 / 孔），培养 4-5 天后，未融合细胞死亡，仅杂交瘤细胞存活（需每日观察细胞状态，更换 1/2 培养基）。

3. 阳性克隆筛选与克隆化

   • ELISA 初筛：以重组 CHW 蛋白包被 96 孔板（1 μg/mL），加入培养上清，筛选 OD 值≥阴性对照 2.1 倍的孔；
   • 有限稀释法克隆化：将阳性孔细胞按 0.5 个 / 孔接种至 96 孔板，重复 3 次克隆化，直至获得单克隆细胞株（确保单克隆抗体特异性）。

（四）单克隆抗体生产与纯化

1. 腹水制备（大量生产）

   • 给 Balb/c 小鼠腹腔注射石蜡油（0.5 mL / 只）预处理，7 天后接种杂交瘤细胞（1×10^6 个 / 只）；
   • 7-10 天后收集腹水，4℃离心（3000 rpm，10 分钟），上清经 0.22 μm 滤膜过滤。

2. 细胞培养（小规模生产）

   • 杂交瘤细胞在无血清培养基（如 SFM4CHO）中悬浮培养，收集上清（抗体浓度约 50-200 μg/mL）。

3. 抗体纯化

   • 腹水纯化：先用 50% 硫酸铵沉淀去除杂蛋白，再通过 Protein G 亲和层析（针对 IgG 类抗体）或离子交换层析进一步纯化，PBS 透析脱盐；
   • 上清纯化：直接经亲和层析或超滤（10 kDa 截留分子量）浓缩，SDS-PAGE 验证纯度。

（五）抗体鉴定与质量控制

1. 效价测定

   • ELISA 法检测腹水抗体效价（应≥1:10^5），上清效价≥1:10^3。

2. 特异性验证

   • Western blot：检测抗体与天然 CHW 或重组 CHW 的结合特异性，同时验证是否与犬其他激素（如胰岛素、IGF）交叉反应；
   • 免疫组化：对妊娠犬胎盘组织切片进行染色，确认抗体对 CHW 的定位特异性（如滋养层细胞表达）。

3. 亚型与亲和力测定

   • 用小鼠单克隆抗体亚型试剂盒确定 Ig 亚型（如 IgG1、IgM）；
   • 表面等离子共振（SPR）或 ELISA 竞争法测定抗体与 CHW 的亲和力（KD 值≤10^-8 M 为高亲和力）。

三、关键技术难点与解决方案 难点 解决方案 CHW 抗原免疫原性弱 优化重组表达系统（如真核表达保持二硫键），选择 KLH 作为载体蛋白，增加免疫次数 杂交瘤细胞融合效率低 使用对数生长期骨髓瘤细胞，PEG 作用温度精确控制在 37℃，融合后及时换液 非特异性抗体干扰 纯化抗原时增加洗涤步骤，克隆化时严格筛选，并用天然 CHW 验证交叉反应 抗体亲和力不足 采用高亲和力克隆筛选方法（如 SPR），或通过抗体工程技术（如 CDR 区突变）优化 四、应用场景

1. 临床诊断

   • 制备犬妊娠检测试纸条（检测血清 / 尿液中 CHW 水平），用于早期妊娠诊断或流产预警；
   • 开发 ELISA 试剂盒，辅助诊断犬子宫蓄脓、卵巢功能异常等繁殖疾病。

2. 基础研究

   • 免疫荧光定位 CHW 在犬生殖器官中的表达分布；
   • 免疫沉淀（IP）结合质谱分析 CHW 互作蛋白，研究其信号通路。

3. 药物研发

   • 作为工具抗体筛选 CHW 受体拮抗剂，用于治疗犬早产或异常妊娠；
   • 抗体偶联药物（ADC）研究（实验阶段），靶向递送药物至 CHW 高表达组织。

五、注意事项

1. 抗原构象：CHW 含二硫键，重组表达时需确保正确折叠，否则可能影响抗体识别表位；
2. 动物伦理：免疫实验需符合 AAALAC 或当地动物保护法规，使用镇痛剂减少动物应激；
3. 保存条件：纯化抗体分装后 - 20℃保存（避免反复冻融），加入 0.02% 叠氮钠防止污染；
4. 应用优化：根据实验目的（如诊断或研究）调整抗体工作浓度，通过预实验确定最佳条件。

通过上述流程制备的犬松弛素单克隆抗体，可满足从基础研究到临床应用的多场景需求，其核心在于抗原设计的合理性、杂交瘤筛选的严谨性及抗体功能的系统性验证。