本文介绍了一种用于高分辨率生物打印的新型聚 N - 异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）基双凝胶墨水和热可逆泊洛沙姆支撑浴系统。该墨水通过快速热凝胶化和自发共价交联反应，结合支撑浴在水合加热环境中维持结构，可产生直径 80-200μm 的均匀纤维多层结构。研究通过流变学分析、打印实验和细胞兼容性测试，阐明了打印因素间的关系，证明了该系统在无细胞和细胞负载支架高分辨率打印中的能力，为挤压基生物墨水与支撑浴的打印研究提供了新方向。
 
一、研究背景与目的

• 挤压生物打印的挑战：传统挤压打印因墨水高粘度（10s-1000s Pa・s）限制喷嘴尺寸，难以实现百微米以下分辨率。
• 创新解决方案：开发 PNIPAAm 基双凝胶墨水与泊洛沙姆支撑浴系统，利用热凝胶化和共价交联，结合支撑浴维持结构，提升打印分辨率。

二、材料设计与制备

• 热凝胶大分子（TGM）合成
  • 组成：NIPAAm（86.5 mol%）、GMA（7.5 mol%）、DBA（3.5 mol%）、AA（2.5 mol%），AIBN 引发剂。
  • 特性：LCST onset 19.9±0.7℃，peak 25.5±1.0℃，分子量 Mn=19849 Da，PDI=2.76。
• 交联剂（PAMAM）合成：MBA 与哌嗪（3:4 molar ratio）反应，Mn=1776 Da。
• 墨水与支撑浴制备
  • 墨水：TGM 与 PAMAM 按 4:3 质量比混合，浓度 17.5%-35% w/v。
  • 浴：泊洛沙姆 F-108 溶于水，浓度 25%-35% w/v。

三、关键实验方法

• 流变学分析
  • 粘度：TGM 墨水 < 1 Pa・s（12.5℃），浴在 37℃具剪切稀化特性。
  • 模量：浴 G' 为 7.5-17 kPa（25%-35% 浓度），yield stress 57.4-174.6 Pa。
• 打印实验
  • 设备：Cellink BIO X 3D 打印机，喷嘴 25G-32G。
  • 条件：墨水 12.5℃，浴 37℃，打印压力 5-35 kPa。
  • 评估：纤维直径、孔隙 Pr score、形状 / 面积均匀性。
• 细胞兼容性
  • leachables assay：L929 细胞 viability>80%（1X-100X 稀释）。

打印 viability：26.25% 墨水组 3 h viability 43.6±3.2%，24 h 42.3±1.4%。 了解更多——CEELINK  BIO X
  四、主要结果

指标	结果
纤维直径	80-200 μm（27G-32G 喷嘴），随墨水浓度增加而增大
孔隙 Pr score	27G 组 > 1.0，32G 组 35% 墨水组显著升高
形状均匀性	27G 组 > 0.8，32G 组 35% 墨水组降低
面积均匀性	27G 组 > 0.9，32G 组 17.5% 墨水低浓度浴降低
弹性模量	17.5% 墨水：9.5±3.4 kPa；35% 墨水：12.0±4.8 kPa

五、结论与意义

• 技术突破：实现 10s 微米级分辨率，大支架（5 mm 高）打印成功。
• 材料优势：双凝胶机制结合泊洛沙姆浴，兼顾结构稳定性与细胞兼容性。
• 应用前景：为骨软骨组织工程提供高分辨率支架，推动热凝胶材料在生物打印中的应用。

  关键问题
1. 该研究中双凝胶墨水的交联机制是什么？
答案：双凝胶墨水基于 PNIPAAm 的热凝胶化和 PAMAM 交联剂的共价交联。PNIPAAm 在高于 LCST（25.5℃）时快速热凝胶化，形成物理网络；同时，PAMAM 与 TGM 中的 GMA 环氧基团发生胺 - 环氧反应，形成共价交联网络，增强机械性能并防止脱水收缩。
2. 泊洛沙姆支撑浴在打印中的关键作用是什么？
答案：泊洛沙姆支撑浴在 37℃形成凝胶，为低粘度墨水提供机械支撑，维持挤出纤维的形状 fidelity。浴具高储能模量（7.5-17 kPa）和 yield stress（57.4-174.6 Pa），可自愈合并传导热量，确保墨水快速热凝胶化，同时维持水合环境适合细胞培养。
3. 该系统实现的打印分辨率如何，细胞兼容性表现怎样？
答案：打印分辨率可达纤维直径 80-200 μm，孔隙形状均匀性 > 0.8。细胞兼容性方面，leachables 无毒性，打印后 3 h 和 24 h 细胞 viability 约 43%，表明系统可用于细胞负载支架打印，虽 viability 有待提升，但证明了可行性。

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