缺血性中风是全球致残和致死的主要病因之一，即便大血管成功再通，仍有部分患者因“无复流”现象（大血管再通但组织未恢复灌注）预后不佳。“无复流”的核心机制——微血管阻塞，长期以来因缺乏能同时观察大脑皮层和皮层下区域的三维成像技术而难以破解。

华中科技大学朱丹团队在《Theranostics》（2023年第13卷第1期）发表研究，开发了一种基于双荧光标记和组织透明化的三维微血管成像技术。通过在小鼠缺血再灌注模型中注射两种不同颜色的番茄凝集素（分别标记所有血管和功能性血管），结合iDISCO+组织透明化技术和光学成像，首次实现了缺血后微血管阻塞的三维可视化。研究发现，微血管阻塞随时间逐渐加重，同时涉及小动脉和毛细血管，其中毛细血管阻塞与管腔狭窄及中性粒细胞滞留密切相关，且中性粒细胞主要通过加剧管腔狭窄而非直接栓塞导致阻塞。

重要发现
01双荧光标记策略：精准定位阻塞血管
传统方法难以区分“存在但不流通”的血管与“正常流通”的血管。朱丹团队设计了一种“时间差”标记法：

红色凝集素：在缺血前注射，标记所有存活的血管（无论后续是否通畅）；

绿色凝集素：在再灌注后注射，仅标记仍有血流通过的功能性血管。

原理：若某段血管仅显红色，说明其在缺血后阻塞，无法让绿色凝集素流过——这便是“微血管阻塞”的直接证据。通过这种方法，研究团队在小鼠大脑中清晰识别出仅含红色信号的阻塞血管，主要分布在纹状体（比皮层更严重），证实了缺血核心区的微血管损伤差异。

02 iDISCO+组织透明化：从“混沌脑块”到“透明标本”
大脑组织本身不透明，传统切片成像仅能获取二维信息，且易遗漏深层结构。研究团队对比了多种透明化技术（如CUBIC、PACT、uDISCO等），最终选择iDISCO+，因其能最大程度保留荧光信号、维持组织形态，且透明速度快。

流程：固定后的脑组织经甲醇脱水、过氧化氢漂白、二氯甲烷脱脂，最终浸泡在二苄醚（是一种用于组织光学透明化处理的溶剂）中，变得近乎透明。

效果：结合共聚焦显微镜或光片显微镜，可对1毫米厚的脑块或全脑进行三维成像，清晰呈现皮层和纹状体的血管网络，甚至能分辨直径仅数微米的毛细血管。

03 三维成像揭示阻塞动态：从“局部卡顿”到“全局瘫痪”
通过对不同再灌注时间（0.5小时、2小时、6小时）的小鼠大脑成像，发现：
阻塞范围随时间扩大 ：从下游毛细血管逐渐向上游小动脉蔓延，6小时时阻塞血管体积较0.5小时增加近3倍；

阻塞位置多样化：不仅发生在有平滑肌细胞标记（αSMA抗体）的小动脉，也出现在无平滑肌的毛细血管，且毛细血管阻塞处的管腔直径显著缩小。

04 中性粒细胞的“帮凶”角色：挤窄血管而非堵死通道
以往研究认为中性粒细胞像“塞子”一样直接栓塞毛细血管，但朱丹团队的三维成像发现：

多数阻塞点无中性粒细胞：在78个阻塞点中，56个未见中性粒细胞，说明栓塞并非主要机制；

中性粒细胞加剧管腔狭窄：在有中性粒细胞的阻塞点，细胞被压缩成“爪状”，紧贴狭窄的血管壁，且周围血管壁细胞（如周细胞）的细胞核呈现收缩形态。进一步实验显示，用抗体清除中性粒细胞后，毛细血管直径恢复正常，阻塞程度显著减轻。

用抗Ly6G抗体治疗后I/R后缺血核心和脑微循环中中性粒细胞的微血管阻塞减少

 血管直径的量化

创新与亮点

01 从“平面”到“立体”：破解脑深部成像难题
传统光学显微镜只能观察皮层表面血管，而临床中风患者的深部核团（如纹状体）常受累更重。本研究通过iDISCO+透明化和全脑三维成像，首次实现了对大脑深层微血管的系统性分析，发现纹状体阻塞程度是皮层的2倍以上，为解释临床“大血管通而深部组织仍梗死”提供了直接证据。
02 从“静态”到“动态关联”：细胞-血管互作一目了然
结合免疫标记（如αSMA区分动脉/毛细血管、Ly6G标记中性粒细胞）和三维重建，研究团队能精准定位阻塞点与细胞的关系。例如，通过叠加血管（红/绿）、中性粒细胞（紫）和细胞核（蓝）的信号，清晰看到中性粒细胞如何卡在狭窄的毛细血管中，以及周细胞收缩如何“掐窄”血管——这种“空间关联分析”是传统二维切片无法实现的。
03 从“现象描述”到“机制突破”：重新定义中性粒细胞作用
该研究推翻了“中性粒细胞主要通过栓塞导致无复流”的传统观点，证实其核心危害是通过释放活性氧等物质，加剧周细胞收缩和血管狭窄。这为靶向治疗提供了新方向：相比“清除中性粒细胞”，“抑制周细胞收缩”或“改善血管弹性”可能更有效。

总结与展望
朱丹团队的这项研究，通过“双标记+透明化+三维成像”的组合拳，为缺血性中风的微血管研究打开了新视野。其核心价值不仅在于揭示了“血管狭窄+中性粒细胞协同致病”的机制，更在于提供了一套可重复、可量化的技术平台——未来可用于：

药物研发：快速评估抗狭窄或抗中性粒细胞药物对微血管的改善效果；

基础研究：解析其他神经疾病（如阿尔茨海默病）中的微血管异常；

临床转化：结合荧光分子成像技术，探索活体三维微血管成像的可能性。

当然，目前该技术仍需优化（如缩短透明化时间、提升单细胞分辨率），且小鼠模型与人类中风的差异需进一步验证。但毫无疑问，这种“眼见为实”的三维成像策略，正在改写我们对大脑微观世界的认知。随着技术迭代，或许有一天，医生能通过无创三维成像实时监测患者的微血管状态，让“无复流”不再成为中风治疗的“盲区”。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Li Y, Xu J, Yu T, Zhu J, Xuan A, Liu X, Wang P, Li D, Zhu D. A labeling strategy for the three-dimensional recognition and analysis of microvascular obstruction in ischemic stroke. Theranostics. 2023 Jan 1;13(1):403-416. 

DOI:10.7150/thno.76879.