研究背景 紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作为全球重要的优质牧草之一，其杂交育种对提升产量和品质至关重要。然而，作为异花授粉的异源四倍体作物，苜蓿的基因组复杂性使其雄性不育的分子机制长期成谜。花药发育作为植物生殖的核心过程，涉及绒毡层分化、花粉壁形成等精密环节，而MYB家族转录因子在拟南芥等模式植物中已被证实为关键调控因子，但在苜蓿中仍未得到充分研究。 文献解读 2025年3月17日，吉林农业大学徐博教授团队在Plant Journal发表了题为“Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development”的研究论文。该研究聚焦紫花苜蓿中MsMYB35基因，借助DAP-seq技术首次在全基因组范围内锁定其结合位点，揭示了该基因通过茉莉酸信号通路和细胞壁重塑通路调控花药发育的分子机制，为解析苜蓿花药发育的调控机制及分子育种提供理论依据。 技术路线 研究结果 研究发现，紫花苜蓿MsMYB35基因在花药中表达量显著高于根、茎、叶，且在雄性不育系MSJN1A的小孢子母细胞和四分体时期表达量低于保持系MSJN1B。原位杂交显示，该基因转录本从小孢子母细胞期至成熟花粉期存在于小孢子与绒毡层细胞，推测在花药发育早期（尤其四分体时期）起重要作用。MsMYB35属于R2R3-MYB转录因子家族，其N端含经典R2R3结构域。系统发育分析显示，MsMYB35与蒺藜苜蓿（MtMYB35）、大豆（GmMYB35）等物种的同源蛋白进化关系密切，功能保守，可能参与花药发育和花粉形成。亚细胞定位显示其定位于细胞质和细胞核（以核膜为主），表明其可能通过调控核内转录及胞质过程参与花药发育调控。 图1. MsMYB35基因表达分析。

图2. 紫花苜蓿MsMYB35的氨基酸序列比对与系统发育分析。

图3. MsMYB35亚细胞定位分析。 为研究MsMYB35转录调控机制，作者通过DAP-seq鉴定出MsMYB35在基因组中的14,992个结合峰，其中8,097个高可靠性位点主要分布于基因间区（62.7%）和启动子区（16.6%），富集到AAAAA、TAAC、GA(A/G)三类保守基序，对应3,647个靶基因。GO富集分析显示，这些基因富集于“植物激素信号转导”、“花发育调控”等生物过程。结合RNA-seq数据，筛选出467个直接调控基因（261个正调控、207个负调控）。KEGG富集分析显示，其显著富集于苯丙烷代谢、茉莉酸（JA）合成、细胞壁重塑（如果胶裂解酶通路）等与花药发育密切相关的代谢途径。进一步通过酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告实验证实MsMYB35可直接结合MsJMT和MsPL的启动子并激活其转录，表明其通过调控JA甲基转移酶和果胶酸裂解酶影响花药发育。外源MeJA处理实验表明，不育系花药发育缺陷可通过MeJA处理部分恢复，证实MsMYB35-JA通路在绒毡层发育和花粉成熟中的核心作用。 图4. 通过DAP-seq技术对MsMYB35结合位点进行的全基因组鉴定。

图5. RNA-seq与DAP-seq数据联合分析。

图6. MsMYB35靶向花药发育相关基因启动子。

图7. 不同发育阶段花蕾中茉莉酸(JA)含量变化及对应花药形态特征。 为进一步探究MsMYB35的功能，作者构建了MsMYB35-OE和RNAI转基因植株。RT-PCR显示，MsMYB35-OE株系基因表达显著上调，RNAi株系则显著下调。表型分析表明，过表达株系与野生型无明显差异，而RNAi株系出现生长抑制、分枝减少、开花延迟等现象。组织学分析表明，RNAi植株在四分体阶段即出现绒毡层结构不连续，单核期花粉液泡化，双核期表皮破裂，成熟花粉无法形成。研究表明MsMYB35表达水平直接影响绒毡层发育、花粉壁形成及花药开裂过程，其适当表达是花粉正常发育的必要条件，为解析苜蓿雄性不育机制及分子育种提供了关键依据。 图8. 转基因苜蓿与野生型植株中MsMYB35基因的表达水平。

图9. 野生型和过表达MsMYB35紫花苜蓿不同发育阶段的细胞学观察。

图10. 苜蓿花药发育中MsMYB35的调控网络模型。