Tubulin Acetylation Enhances Microtubule Stability in Trabecular Meshwork Cells Under Mechanical Stress

Keywords: trabecular meshwork, glaucoma, tubulin acetylation, mechanical stress

小梁网（TM）/Schlemm 管（SC）常规流出通道中的机械力被认为在调节房水（AH）稳态和眼压（IOP）中起关键作用。由于脉动或活动（如眨眼和扫视）引起的压力差和眼压波动，流出通道内的细胞会经历拉力或机械拉伸。此外，流出通道细胞在流经 TM 和 SC 组织时会受到 AH 流动产生的剪切应力。

机械拉伸会触发细胞骨架中的动态响应，根据应力的大小和持续时间，细胞骨架可能会流化以适应力或加强以抵抗力。这种机械反应涉及细胞骨架成分（包括微管）之间的复杂协调，微管在感应机械力和稳定细胞结构方面起着关键作用。大量研究表明，TM 和 SC 细胞都可以感知机械力并通过触发旨在调节各种流出阻力的细胞过程（包括细胞骨架重塑）来做出反应。但目前还没有研究探讨机械拉伸与 TM 和 SC 细胞中微管（MT）细胞骨架之间的关系。

微管蛋白乙酰化，特别是在 α-微管蛋白第40位的赖氨酸（K40）残基上，是一种与 MT 的稳定性和机械特性相关的关键翻译后修饰。微管蛋白乙酰化增强了微管的柔韧性和弹性，对机械应力起到保护作用并防止结构损伤。

最近，在美国杜克大学眼科中心及俄勒冈健康与科学大学凯西眼科研究所的一项研究中，探讨了对照组和青光眼组 TM 细胞微管蛋白乙酰化响应循环机械拉伸（CMS）的动态调控和功能意义，以及微管蛋白乙酰化对小鼠体内 IOP 的作用。这是第一项探索微管蛋白乙酰化在流出通道动力学调节中的功能研究。研究成果发表于 Investigative Ophthalmology & Visual Science 期刊题为“Tubulin Acetylation Enhances Microtubule Stability in Trabecular Meshwork Cells Under Mechanical Stress”。


首先，使用蛋白质印迹和免疫荧光分析研究了在有和没有 CMS （8% 伸长率）的人眼小梁网细胞（HTM）原代培养物中赖氨酸40 （Ac-TUBA4）处 ⍺-微管蛋白乙酰化的发生情况。结果显示，TM 细胞中 Ac-TUBA4 的组成型基础水平（图1 A）。与未拉伸对照相比，拉伸处理培养物中 Ac-TUBA4 水平显著升高。免疫荧光证实，CMS 作用下 Ac-TUBA4 增加（图1 B、C）。还观察到细胞定位的变化。Ac-TUBA4 主要位于未拉伸细胞的核周区域，并且在拉伸细胞中显示出更广泛的细胞质染色。这表明，循环机械拉伸在 TM 细胞中诱导微管蛋白乙酰化。

MT管腔内通过α-微管蛋白乙酰转移酶（α-ATAT1）对α-微管蛋白进行K40乙酰化，随后通过HDAC6和SIRT2进行脱乙酰化。特异性敲低 ATAT1、HDAC6 和 SIRT2，通过蛋白质印迹评估 Ac-TUBA4、SIRT2 和 HDAC6 的水平。与对照细胞相比，敲低 ATAT1 导致 Ac-TUBA4 水平显著降低，相反，敲低 HDAC6 导致 Ac-TUBA4 水平增加，而敲低 SIRT2 没有显著影响。这些结果表明，ATAT1 和 HDAC6 分别调节 TM 细胞中的微管蛋白乙酰化和脱乙酰化。

随后检查了这些酶的表达在 CMS 条件下是否发生改变。与未拉伸培养物相比，CMS 显著降低了 HDAC6 蛋白水平。SIRT2 水平略有下降，但未达到统计学意义。未观察到 CMS 下 ATAT1 mRNA 水平发生变化。这些发现表明，CMS 通过下调 HDAC6 来增加 Ac-TUBA4，从而降低微管蛋白脱乙酰化的速率。

图1 CMS 下 TM 细胞中的微管蛋白乙酰化。

接下来，使用从受青光眼（GTM）和年龄匹配对照组（NTM）影响的供体眼睛中分离的 TM 细胞的原代培养物重复上述实验。值得注意的是，在非拉伸条件下，与 NTM 培养物相比，GTM 培养物表现出更高水平的 Ac-TUBA4 （图2 A）。然而，在 GTM 细胞和 NTM 细胞之间未观察到 HDAC6 或任何 SIRT2 亚型表达的显著差异（图2 A）。CMS 的应用进一步增加了 GTM 细胞中 Ac-TUBA4（图2 B）。这表明，青光眼型 TM 细胞中的微管蛋白乙酰化水平升高。

越来越多的证据表明，与同龄对照眼相比，青光眼的 TM 更僵硬。因此，研究了 GTM 细胞中较高的 Ac-TUBA4 水平是否是由于刚度增加造成的，检测在不同基质刚度上（5-kPa 和 60-kPa；900-kPa；∼1 GPa）培养的 NTM 和 GTM 细胞裂解物中的 Ac-TUBA4 水平。无论基质刚度如何，与 NTM 细胞相比，GTM 细胞始终表现出更高的 Ac-TUBA4 含量。在 NTM 细胞中未观察到基质刚度对 Ac-TUBA4 水平的影响。总体而言，实验结果不支持底物刚度对微管蛋白乙酰化的直接影响。

图2 非拉伸和 CMS条件下青光眼 TM 细胞中的微管蛋白乙酰化。

对其他细胞类型的研究表明，微管蛋白乙酰化在调节细胞收缩性中的作用。鉴于 TM 细胞收缩性与 AH 流出的相关性，在 ATAT1（siATAT1）敲低表达的 TM 细胞中进行了基于胶原蛋白的凝胶细胞收缩性测定，TGFβ2（10 ng/mL）处理的细胞作为阳性对照。正如预期的那样，TGFβ2 处理促进了细胞收缩性，而沉默 ATAT1 表达导致胶原凝胶松弛，Ac-TUBA4 水平较低。此外，ATAT1 敲低还抑制了 TGFβ2 诱导的收缩性。

进一步实验评估了 tubacin 的作用，tubacin 是一种有效的 HDAC6 抑制剂，可抑制微管蛋白脱乙酰化，导致乙酰化微管蛋白含量显著增加。出乎意料的是，tubacin 处理导致 TGFβ2 诱导的细胞收缩性降低。尽管乙酰化微管蛋白含量要高得多，但 tubacin处理并未逆转在 siATAT1 转染培养物中观察到的细胞松弛。

此外，还探讨了 Rho 激酶抑制剂是否可以改变微管蛋白乙酰化水平，结果表明，在Y27623 处理的 TM 细胞中未检测到 Ac-TUBA4 水平的显著变化（图3）。这些发现支持 ATAT1 在调节 TM 细胞收缩性中的作用，而不是微管蛋白乙酰化。

图3 Rho 激酶抑制剂对微管蛋白乙酰化的影响。

K40 位点微管蛋白的乙酰化被认为可提供稳定性并防止微管破裂。研究人员旨在确定 tubacin 处理诱导的微管蛋白乙酰化水平升高是否可以防止 nocodazole（一种已知的微管解聚剂）诱导的微管解聚。图像显示，tubacin 处理的细胞中微管弯曲更少、更长，并且裂缝更少。此外，与 siCNT 转染细胞相比，nocodazole 处理导致 siATAT1 中更快速和显著的解聚效应，在30 分钟后几乎没有观察到可见的完整乙酰化微管。这些数据表明，微管蛋白乙酰化可防止 TM 细胞中的微管破裂。

最后，实验研究了微管蛋白乙酰化对 IOP 的影响，将tubacin（10 μM）注射到C57BL / 6J小鼠的前房中，对侧眼接受DMSO载体对照注射，记录昼夜眼压测量值（图4 A、B）。注射 tubacin的眼睛在第 1 天、第 2 天和 第 3 天观察到眼压显著降低，逐渐恢复到基线水平。这表明 tubacin 对 IOP 的降低作用主要归因于前房内注射而不是局部应用，验证了单独局部应用 tubacin 没有显著的降眼压作用。通过免疫荧光证实，注射tubacin的眼睛的TM和睫状体中的Ac-TUBA4水平较高（图4 C）。

图4 Tubacin 处理可降低小鼠的 IOP。

总之，该研究强调了微管蛋白乙酰化在 TM 细胞对机械应力的反应中的关键作用及其对 IOP 调节的潜在影响。机械拉伸通过下调 HDAC6 诱导 TM 细胞中的微管蛋白乙酰化，从而增强 MT 稳定性。青光眼 TM 细胞中微管蛋白乙酰化升高表明存在抵消增加的机械负荷的代偿机制。虽然微管蛋白乙酰化似乎不直接调节 TM 细胞收缩性，但它对 MT 不稳定起保护作用。体内 tubacin 对 IOP 的降低作用强调了在青光眼治疗中调节微管蛋白乙酰化的治疗潜力。未来的研究应探索 ATAT1 对细胞收缩性影响的分子机制，并探讨靶向微管蛋白乙酰化在眼生理学和病理学中的长期影响。

参考文献：Su CC, Desikan V, Betsch K, Shim MS, Keller KE, Liton PB. Tubulin Acetylation Enhances Microtubule Stability in Trabecular Meshwork Cells Under Mechanical Stress. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025 Jan 2;66(1):43. doi: 10.1167/iovs.66.1.43. PMID: 39820277; PMCID: PMC11753476.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39820277/

ISSN：0146-0404

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