自闭症谱系障碍（ASD）是神经发育障碍，表现为儿童早期出现社交、沟通和行为障碍。流行病学研究表明，妊娠期和婴儿期维生素D缺乏（称为发育期维生素D缺乏）与后代患自闭症的风险之间存在关联。发育期维生素D（DVD）缺乏症是自闭症的一个流行病学上已确立的风险因素。另外，新兴研究也发现了肠道微生物群在自闭症中的作用。因此，本研究旨在探讨DVD缺乏症对广泛的自闭症相关行为表型和肠道健康的影响。

方法
对维生素D缺乏组和对照组的小鼠进行母性行为观察、超声波发声（USV）测试、幼鼠寻回测试、社交玩耍行为测试、重复性自我梳理行为测试以及肠道生理评估、肠道微生物测量等。母性行为主要记录10次观察期间母体行为数量，例如舔舐/梳理和弓背哺乳。在超声波发声测试中，将幼鼠与母鼠分离，放置在隔音箱中，通过放置在幼鼠头部上方约10厘米的麦克风进行收集，使用诺达思的声音行为分析系统(UltraVox XT)进行持续三分钟的记录并分析。幼鼠寻回测试主要测量寻回母鼠幼崽第一只到第五只幼崽的潜伏期。社交玩耍行为测试中，使用诺达思的行为观察记录分析系统(The Observer XT)记录10分钟动物自由互动过程并进行数据分析，记录社交玩耍行为的参数包括互动潜伏期、猛扑频率、压制和总玩耍持续时间等。重复性自我梳理行为测试是使用诺达思的行为观察记录分析系统对动物梳理自身任何部位的自我梳理行为的次数和持续时间进行评分。幼崽出生的当天被指定为出生后第0天(P0)。
 

  结果
DVD缺乏症改变了与自闭症相关的母性和后代行为
在本研究中，观察到DVD缺陷型母鼠舔舐/梳理行为的增加（图1），这反映了母鼠和幼鼠的焦虑或应激状态增强，因为在啮齿动物中，母鼠应激与此类梳理行为的频率相关。啮齿类动物母鼠照料行为的变化已被证明会影响介导应激反应的神经系统的发育，进而影响母性行为。
  图1   图2

为了探究幼鼠如何与母鼠互动和沟通，研究者进一步测量了幼鼠的超声波发声（USV）。幼鼠早期最基本的沟通方式是与母鼠分离时发出的USV。DVD缺乏会影响P9时的USV，DVD缺乏的幼鼠在P9时发出更多的数量和更长时间的叫声。就记录USV时的母体行为而言，DVD缺乏会增加幼崽在P9时的USV数量和叫声持续时间（图2），这与母鼠更快地寻回幼崽速度相对应。幼崽的USV是母鼠寻回幼崽的重要触发因素。增加的USV可能代表DVD缺乏幼崽的高度焦虑或压力状态。在这个年龄段，幼崽的USV可能驱动母体行为。

与对照组大鼠相比，缺乏DVD的青少年大鼠的猛扑行为显著减少（图3），总玩耍时长或互动潜伏期未发现差异。与对照组相比，DVD缺乏组大鼠的自我梳理次数增加（图4）。
 

图3
  图4

本文研究中P35 DVD缺陷动物在与同类动物相处时表现出更高的自我梳理频率，这与它们减少的社交互动相一致。

DVD缺乏症改变了与自闭症相关的肠道健康相关结果
研究结果表明，虽然DVD缺乏症并未改变母体肠道微生物组的组成，但DVD缺乏症后代和对照组后代的肠道微生物组之间存在差异。研究发现了四种细菌（Akkermansia、Fusicatenibacter、Allobaculum和Turicibacter），其在后代中的相对丰度因 DVD 缺乏而发生显著改变。

在行为方面，发现Phascolarctobacterium菌属和Paracteroides菌属与DVD缺乏组中猛扑行为的频率呈负相关，但在对照组中则不然。Parasutterella属也与对照组中猛扑行为的频率呈负相关，但在DVD缺乏组中则不然。

另外，与对照组动物相比，DVD缺陷型动物的肠道绒毛长度有所降低。并且，与对照组相比，DVD缺陷动物回肠中的ProPIonate（图5A）水平升高，然而，acetate（图5B）和butyrate（图5C）水平没有差异。
 

图5   总结
本研究的主要目标是DVD缺乏症对广泛的自闭症相关行为表型和肠道健康的影响。研究结果发现，维生素D缺乏的大鼠母亲表现出改变的母性行为，DVD缺乏的幼鼠表现出增加的超声波发声，并且作为青少年，表现出社交行为障碍和增加的重复性自我梳理行为。DVD缺乏症对肠道健康有显著影响，表现为微生物群的改变、绒毛长度的减少和回肠Propionate水平的升高。本研究的自闭症流行病学验证风险暴露的动物模型显示了更广泛的自闭症相关行为表型，以及现在与社交行为缺陷相关的肠道微生物群的改变，从而提出了DVD缺乏症诱导的ASD样行为可能是由于肠道健康的改变。
参考文献
Tamang M K, Ali A, Pertile R N, et al. Developmental vitamin D-deficiency produces autism-relevant behaviours and gut-health associated alterations in a rat model[J]. Translational Psychiatry, 2023, 13(1): 204.

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