FluorCam多光谱荧光成像 应用于 分子生物学研究——
拟南芥基因敲除：对一种病毒产生抗性，却引发另一种病毒易感？
      马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus），是一类严重影响植物生长生产的植物病毒属，有数百个种，包括大豆花叶病毒（SMV）、三叶草黄脉病毒（CIYVV）、芜菁花叶病毒（TuMV）deng 等。植物中的翻译起始因子4E是对马铃薯Y病毒属敏感的一个小家族。当作物中编码 eIF4E蛋白的天然抗性等位基因缺失时，敲除这些4E家族基因，可以赋予作物遗传抗性。 eIF4E1是4E家族中一个对CIYVV敏感的翻译起始因子，本研究探讨了利用敲除 eIF4E1对拟南芥的病毒抗性的双重影响.
      研究结果表明，敲除eIF4E1后，对CIYVV敏感的植株对三叶草黄脉病毒（ClYVV）表现出抗性，但对芜菁花叶病毒（TuMV）的敏感性显著增强。而通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建功能抗性等位基因eIF4E1可避免对TuMV的超敏反应，同时保留对ClYVV的抗性。研究提示，基因敲除策略可能因病毒利用其他同源因子而存在风险，而模拟天然抗性等位基因是更安全有效的策略。             
      FluorCam多光谱荧光成像系统，除了具备叶绿素荧光成像，可以检测植物光合活性以外，还具备多光谱荧光成像功能，比如FPs荧光蛋白成像、UV-MCF紫外激发多光谱荧光成像等。在这项研究中，FluorCam便承担了检测在病毒侵染下不同基因型拟南芥的衰老、追踪GFP标记病毒分布及量化的双重角色。  

• eIF4E1功能丧失与TuMV感染症状加重有关

使用带GFP标记的TuMV（TuMV-GFP UK1）感染三个基因型的拟南芥，分别为野生型WT；敲除 eIF4E1对CIYVV具抗性的基因型（ eif4e1 ^KO）；敲除 eIF iso4E对TuMV具抗性的基因型（ eifiso4e ^KO）。使用FluorCam检测感染14天、21天之后拟南芥叶绿素荧光变化（表征叶片衰老情况）及GFP表达情况（即TuMV病毒积累程度）。从结果可知， eifiso4e ^KO因其具备的病毒抗性，而无明显的病毒侵染，性状和叶绿素荧光水平无明显变化，而eif4e1 ^KO的GFP信号更强，说明其病毒积累更多，叶绿素荧光成像结果也显示，其感染症状比野生型更为明显，表现为更严重早衰（叶绿素荧光下降）、新叶发育停滞。  

• 基因功能验证：

• 恢复eIF4E1表达后，植株对TuMV的敏感性和病毒积累量恢复至野生型水平

为了确认 eif4e1 ^KO对TuMV易感是否由 eIF4E1缺失有关，通过构建了两个互补系 eif4e1KO ; eIF4E1-1和 eif4e1KO ; eIF4E1-2，在感染TuMV-GFP UK1后，于17天后，分析了它们的表型。FluorCam成像结果表明， eif4e1KO ; eIF4E1-1和 eif4e1KO ; eIF4E1-2的病毒易感性表现恢复到了与野生型相似水平，比 eif4e1 ^KO具有更高的TuMV抗性，证明了 eIF4E1的敲除缺失是 eif4e1 ^KO突变体易感性和病毒积累增加的唯一原因。  

•  CRISPR/Cas9基因编辑技术将eIF4E1转化为抗性等位基因eIF4E1^N176K  

研究中，模拟豌豆 eIF4E等位基因中与抗马铃薯病毒属相关的自然突变基因，通过基因编辑的方法获得非转基因的 eIF4E1 ^N176K植株，侵染实验的结果证明，该基因编辑株对TuMV无超敏反应，且保留对ClYVV的抗性。  
结合研究中的其他实验结果，得出结论，敲除eIF4E1虽赋予植株ClYVV的抗性，但却引发了对TuMV的过度敏感。CRISPR/Cas9基因编辑技术模拟天然抗性等位基因是更优策略，既可维持抗性，又避免对其他病毒的易感性。研究强调基因敲除抗性育种存在潜在风险，而功能性等位基因编辑更具应用前景。

• FluorCam多光谱荧光成像助力叶片衰老和病毒感染程度检测

作为研究中的主要检测手段，FluorCam提供了多方面的数据支撑。叶绿素荧光成像结果体现了叶绿素荧光强度变化量化叶片衰老进程，直观反映病毒感染引发的早衰现象，从而反映叶片衰老。得力于系统非侵入性检测的优点，可以实现实时追踪植株生理状态，避免传统取样对实验的干扰和珍贵样品的破坏。而系统具备的GFP荧光蛋白检测则为可视化病毒分布、量化病毒积累提供、动态监测感染不同阶段病毒与宿主互作的时序性变化提供了可靠数据。FluorCam兼具的两项技术共同为拟南芥抗病毒分子生物学研究提供了高效、直观的表型和分子水平分析工具。

参考文献：
Zafirov, Delyan, et al. "When a knockout is an Achilles’ heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana."Molecular Plant Pathology, 22.3 (2021): 334-347.