在生物医学研究中，光学成像技术是探索微观世界的强大工具。光片荧光显微镜（LSFM）以其高效的体积成像能力脱颖而出。但在长时间成像过程中，光片与检测焦平面的稳定对齐至关重要，否则会导致成像质量大幅下降。传统光片稳定方法依赖于样品的荧光发射，这不仅会干扰科学成像，还会增加样品光漂白的风险。近期，一项发表在《生物医学光学快报》上的研究提出了一种针对斜面显微镜（OPM）的远程焦点稳定技术，无需消耗样品荧光就能实现光片的稳定，为长时间高分辨率成像提供了有力支持。

重要发现
01光学成像中的焦点漂移问题
光片荧光显微镜（LSFM）作为一种先进的光学成像技术，在生物医学领域有着广泛的应用。其通过特定角度的光片照射样品，并由另一方向的检测系统收集荧光信号，从而实现对样品的三维成像。在典型的LSFM中，照明和检测系统分别由两个相互垂直的物镜实现，这就要求光片平面与检测系统的焦平面精确重合。然而，在实际操作中，由于环境因素（如温度变化、机械振动等），检测物镜可能会发生焦点漂移，导致光片与焦平面的相对位置改变，从而影响成像质量。为解决这一问题，研究人员开发了多种自动对焦算法，这些算法通常需要获取一系列荧光图像来估算相对位移，这不仅会消耗荧光信号，还可能中断实际成像过程。

02斜面显微镜（OPM）的创新解决方案
斜面显微镜（OPM）是LSFM的一种变体，它使用单个物镜以斜角发射光片，并用同一物镜检测荧光。在这种设计中，如果主物镜发生漂移，光片和检测会以相同速率漂移，从而保持相对对齐。然而，在OPM中，远程聚焦系统可能会引入类似传统LSFM中的成像退化问题。研究人员通过实验验证了在OPM中使用与荧光检测光谱不同的激光光来稳定远程聚焦单元，该系统无需荧光光即可独立于荧光成像连续运行。实验中，研究人员使用了一种特定波长的激光，通过精确的光学设计和调整，使得激光光能够在不干扰荧光检测的情况下用于远程焦点的稳定。

03实验验证与高精度成像
通过对激光光的实时监测和反馈控制，研究人员实现了约21纳米的轴向精度，并能够在实验室环境中维持长达数小时的稳定成像。在实验中，研究人员展示了使用稳定OPM对黑色素瘤癌细胞的肌动蛋白骨架进行亚细胞成像的结果。这些实验结果表明，该远程焦点稳定技术能够在长时间成像过程中保持光片与检测焦平面的精确对齐，从而显著提高成像质量，并减少因焦点漂移导致的模糊。此外，研究人员还通过长时间成像实验验证了该技术的稳定性，发现在启用焦点稳定功能后，系统的轴向漂移显著降低，成像分辨率在整个实验过程中保持稳定。

创新与亮点
创新之处在于提出了一种无需消耗样品荧光的远程焦点稳定方法，专门针对斜面显微镜（OPM）这一特殊的光片荧光显微镜（LSFM）变体。该方法利用与荧光检测光谱不同的激光光，通过独特的光学设计，使得激光光能够在不干扰荧光信号的情况下实现对远程聚焦系统的实时监测和反馈控制。这种方法不仅避免了传统光片稳定方法中因获取荧光信号而导致的样品光漂白和成像中断问题，还实现了极高的轴向精度（约21纳米）和长时间（数小时）的稳定成像能力，为长时间高分辨率的生物医学成像提供了一种全新的解决方案。

总结与展望
这项研究为光片荧光显微镜（LSFM）领域带来了重要的技术突破，特别是在斜面显微镜（OPM）的远程焦点稳定方面取得了显著进展。不仅为生物医学研究中的长时间观察提供了更可靠的技术支持，也为未来光学成像技术的发展提供了新的思路和方向。未来，通过引入更先进的光学元件和控制算法，有望进一步提高该技术的稳定性和精度。该技术也有望与其他先进的光学成像技术相结合，为生物医学研究提供更全面、更高效的成像解决方案。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Nguyen TD, Rahmani A, Ponjavic A, Millett-Sikking A, Fiolka R. Active Remote Focus Stabilization in Oblique Plane Microscopy. bioRxiv [Preprint]. 2024 Dec 2:2024.11.29.626121. doi: 10.1101/2024.11.29.626121. Update in: Biomed Opt Express. 2025 Feb 26;16(3):1216-1224.

DOI:10.1364/BOE.553545.